加载机械振动对骨髓间质干细胞粘附和碱性磷酸酶活性的影响

黄岚峰,邵国喜,张延哲,赵劲松

(吉林大学 第二医院1.骨科;2.眼科,吉林 长春 130041）

随着生物学和材料科学的发展,组织工程技术已被众所周知和越来越多地应用于再生医学领域,与此同时,机械工程的方法也比以前更多地与生命科学相结合。种子细胞以高活性生长粘附在的基质材料的表面是组织工程的研究中至关重要的问题,本研究的目的是研究间质干细胞在向成骨细胞分化过程中观察通过加在机械振动对MSCs粘附性能和碱性磷酸酶活性的影响,探讨一种促进种子细胞以高活性与基质材料粘附的方法。

1 材料与方法

1.1 细胞的来源和培养

大鼠Fischer344,7周龄,雌性,共4只作为本实验的细胞来源。大鼠通过过量的乙醚麻醉处死,然后在洁净操作台中取出双侧的股骨、胫骨和肱骨,在超净台中切除股骨松质骨的部分,用含10%胎牛血清(FBS）、1%抗生素(Antibiotics）的DMEM(Dulbecco'sModified Eagle Medium）培养液将骨髓腔的细胞冲洗至离心管中,骨髓细胞经离心(1 500 rpm）后在T-75培养瓶中进行原代培养,4日后首次更换培养液,然后每隔两日更换培养液同时去除未贴壁的细胞,1周左右待细胞长满单层后,用5ml PBS冲洗,0.25%Tripsin-0.02%EDTA 3 ml于37℃CO2孵箱中消化细胞约5分钟,显微镜观察细胞收缩、细胞间裂隙明显增大,用5 ml DMEM终止消化,并吹打细胞成单细胞悬液,离心后转移至另一试管中,以4.0×104/cm2的密度种植于6孔培养板中,培养液中加入10%FBS,1%Antibiotics,10-8M地塞米松(Dexamethasone）,80 μ g/ml 维 生 素 C(L-Ascorbic Acid）,以 及10mM beta甘油磷酸钠(Naβ-glycerophosphate）进行成骨细胞活性诱导。

1.2 机械振动的条件

频率(F）=300Hz,加速度(α）=1.4 gm/s2,振动方向(D）为垂直振动,每次加载振动的时间(T）为6 hours,连续振动3 days。实验组细胞传代培养后立即加载机械振动,对照组(I）不加载机械振动。

1.3 观察项目

1.3.1 形态学观察每天在加载振动后用倒置显微镜观察细胞形态学的改变,并随机挑选视野拍照,对细胞集落形成分析计数。

1.3.2 细胞贴壁性分析 加载振动开始计时,以1、2 、3、6 、12、24、48 h 为时间点,观察实验组和对照组的细胞贴壁情况,同时随机选取视野摄片计算机图像分析,PBS冲洗去除未贴壁细胞后,用0.25%胰酶-0.02EDTA处理后细胞计数分析细胞贴壁率。

1.3.3 碱性磷酸酶检测 在细胞培养14 d后于每培养孔中加入界面活性剂NP40 1mL,然后将细胞团加入1 ml微量试管,用超声波细胞破碎器破细胞膜,4℃、13 000 rpm离心 10 min,取 5 μ l样本加入另一试管中,同时加入1 ml ALP反应剂,CO2孵箱孵育30分钟,然后加入0.2N NaOH 2 ml终止反应,测量波长n=410 nm下的吸光度(OD）,同时将ALP反应剂作为阴性对照。计算碱性磷酸酶活性(μ mol/30 min/implant）.

Activity(μ mol/30 min/implant）=(sampleOD410nmblankOD410nm）×200/5.91

2 结果

2.1 倒置显微镜镜观察

2.1.1 细胞集落的形成 实验组在传代培养后的24 h,可见细胞集落的形成,平均形成数为39个/35 mmdish,约为4.1/cm2,48 h后细胞集落逐渐融合,长满单层。对照组中在24 h内未见明显细胞集落形成(图1）。

2.1.2 细胞贴壁性分析 通过倒置显微镜观察,在最初的48 h中,加载机械振动组贴壁细胞密度明显高于对照组,统计学分析显示在培养后的1、2、3、6、12,24及48 h在两组之间有显著性差异(P＜0.05）,72 h后两组无明显差异(P＞0.05）,培养7 d后振动组为3.34×105/cm2,对照组为3.33×105/cm2(图2）。

2.2 ALP检测

在培养终点14 d时,实验组细胞碱性磷酸酶活性为 17.31 ±2.43 μ mol/30 min/implant,对 照 组为16.49±3.12 μ mol/30 min/implant,两组之间碱性磷酸酶活性无明显差异。

图1 实验组MSCs培养后24 h,细胞集落(▲）,40×

图2 实验组与对照组细胞密度比较。*P＜0.05

3 讨论

在组织工程的研究中,一个十分关键的问题就是细胞如何能够均一地粘附在基质材料中,并且能够良好的生长繁殖,表达相应的细胞活性[1]。它依赖于细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质环境之间的粘附作用。这种粘附作用是由细胞表面蛋白家族介导的,被称为细胞表面粘附分子[2-4]。

本实验的结果显示在传代后立即加载机械振动,骨髓间质干细胞可以更快速、更多数量地粘附于培养环境;但是,本实验的研究结果只能证明在振动频率为300 Hz,加速度在1.4 gm/s2的垂直方向的条件下出现的结果,其它振动条件下对细胞粘附和活性的影响尚有待于进一步研究。并形成细胞集落,显示良好的细胞活性在此,通过对比研究可以证实,早期加在机械振动对于细胞贴壁具有重要的作用。同时在此研究中我们发现传代培养后早期细胞克隆只出现于加载振动的实验组中,这里的基质上有待于进一步的研究,我们认为可能是通过机械振动向细胞传递了一种能量,这种能量增加了细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的接触,使细胞表面的粘附分子更容易被激活,所以使细胞更容易与周围的基质材料粘附在一起,形成贴壁生长,与周围的细胞粘附在一起形成细胞集落。

细胞粘附的特性不仅取决于细胞表面粘附分子的表达,而且还依赖于细胞外基质材料的自然状况,比如体积、表面蛋白、表面修饰、表面形态、多孔性以及降解性等细胞与材料之间的界面情况[5]。细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的粘附特性尚需要进一步定性和定量的研究。有文献证实通过加在机械振动,可以促进软骨细胞DNA以及蛋白多糖的合成。通过成骨诱导培养14 d的ALP检测结果显示实验组与对照组振动组之间无明显差异,可以初步判定以本文的方式加载机械振动对MSCs的分泌ALP能力无影响,但MScs分泌产生ALP的能力尚需通过real time PCR等检测分析其mRNA的表达水平进一步证实。

4 结论

在细胞粘附生长的过程中通过加载机械振动,可以明显促进细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的粘附;该方法可用于组织工程中三维细胞培养和体外构建,以获得种子细胞分布均匀、状态良好的组织工程细胞-材料复合物,但加载机械振动的相关具体参数以及对细胞功能活性的影响尚需进一步研究。

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[2]Mann BK,West JL.Cell adhesion peptides alter smooth muscle cell adhesion,proliferation,migration,and matrix protein synthesis on modified surfaces and in polymer scaffolds[J].J Biomed Mater Res,2002,60(1）:86.[3]Buckley CD,Rainger GE,Bradfield PF,et al.Cell adhesion:more than just glue(review）[J].Mol Membr Biol,1998,15(4）:167.

[4]Arai F,Ohneda O,Miyamoto T,et al.Mesenchymal stem cells in perichondrium express activated leukocyte cell adhesionmolecule and participate in bone marrow formation[J].J ExpMed,2002,195(12）:1549.

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