HPLC法测定胞磷胆碱钠片有关物质以及含量

何文胜

(福建生物工程职业学院生物工程系,福建福州 350002)

0 引 言

胞磷胆碱钠片为核苷衍生物,是磷脂生物合成的中间产物,存在于所有细胞中,是磷脂合成的主要辅酶,通过促进卵磷脂的合成而改善脑的功能,表现为意识状态改善、大脑血流量增加及对氧的摄取明显提高。通过增加脑血流量,改善脑代谢和催醒。降低脑血管阻力,增加脑血流而促进脑物质代谢,改善脑循环。另外可增强脑干网状结构上行激活系统的机能,增强锥体系统的机能,改善运动麻痹,故对促进大脑功能的恢复和促进苏醒有一定作用,用于急性颅脑外伤和脑手术后意识障碍。近年来,广泛应用于脑手术和颅脑外伤所引起的意识障碍以及其它中枢神经系统急性损伤引起的功能和意识障碍、震颤麻痹、耳鸣和神经性耳聋及乙醇、安眠药中毒等。

为了有效控制产品质量,保证临床用药安全有效,原检验标准中含量采用紫外分光光度法,有关物质采用薄层色谱法测定[1]。参见文献[2-5],文中建立了HPLC法[6-9]测定胞磷胆碱钠片有关物质以及含量,方法简便、准确、重现性好。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-2010CH T高效液相色谱仪,色谱柱为Grace Smart 4.6 mm ×250 mm 5 μm 。

1.2 试药

胞磷胆碱钠片,福建省闽东力捷迅医药有限公司,批号:091001,091002,091003;

胞磷胆碱钠对照品,中国药品生物制品检定所,批号:140675-200602;

磷酸二氢钠,分析纯,汕头金砂化工厂;

水为超纯水;

三乙胺,分析纯,国药集团化学试剂有限公司;

磷酸,分析纯,上海三鹰化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与适用性试验

色谱柱为Grace Smart RP C184.6 mm×250 mm 5 μm;以磷酸二氢钠溶液(取磷酸二氢钠3.12 g,加水1000 mL溶解,加入三乙胺5 mL,用磷酸调 pH值至 5.0)为流动相;流速1.0 mL·min-1;检测波长 271 nm,进样量20 μL。供试品溶液测定色谱图中,按胞磷胆碱钠的主峰计算,理论板数为7571,分离度为7.6。

2.2 有关物质测定

2.2.1 专属性

精密称取经强光照射(4500 lx±500 lx)、高湿(90%RH ±5%RH,5 d)、高温(90 ℃,24 h)加速破坏的样品细粉约32 mg置于50 mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀。滤过,照上述选定的方法测定,结果表明,用上述方法加速破坏后测定结果均无明显变化。

精密称取辅料细粉约32 mg置于50 mL,加流动相稀释至刻度,依法测定,结果表明,辅料对胞磷胆碱钠的测定无干扰。

2.2.2 定量限

取有关物质项下的对照溶液用流动相稀释10倍。按上述色谱条件测定,记录色谱图,信噪比S/N＞10。

2.2.3 有关物质稳定性实验

分别取有关物质项下的供试品溶液与对照溶液,于室温下放置,按上述选定的方法,在0,2,4,6,8 h分别进样测定,结果供试品溶液的色谱图中杂质百分含量的RSD=2.98%,表明本品在室温下放置8 h内稳定,见表1。

表1 胞磷胆碱钠片有关物质稳定性试验

2.2.4 有关物质测定

精密称取本品细粉32 mg,置于50 mL容量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液2 mL于100 mL的容量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。照上述选定的色谱条件试验,取对照品溶液20 μL注入液相色谱仪。结果表明,各杂质含量均小于1.0%,见表2。

表2 胞磷胆碱钠片有关物质测定试验

2.3 含量测定

2.3.1 专属性

精密称取辅料空白细粉约32 mg置于50 mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀。滤过,精密量取续滤液2 mL置10 mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,照含量测定项下方法测定,结果表明,辅料对胞磷胆碱钠含量测定无干扰。

2.3.2 耐用性

另换一根色谱柱 Thermo ODS-2 HYPERSIL 4.6×250 nm柱对同一份样品溶液进行实验,柱效良好,结果表明,该色谱系统在两根色谱柱上表现无明显差别。

2.3.3 线性关系

精密称取胞磷胆碱钠对照品约 16 mg置200 mL量瓶中,用适量流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,分别精密量取 5,10,15,20,25,30,50 μL进样。按上述选定的条件测定。以对照品进样量(μ g)为横坐标,以峰面积A为纵坐标进行线性回归,回归方程为:A=549471C+6613.3,r=0.99996。结果表明,胞磷胆碱钠在0.403～4.03 μ g范围内与峰面积成良好的线性关系,见表3和图1所示。

表3 胞磷胆碱钠片含量测定线性试验

图1 胞磷胆碱钠片线性图

图中

2.3.4 胞磷胆碱钠片回收率试验

精密称取胞磷胆碱钠对照品约8 mg,10 mg,12 mg(各3份),同时精密称取按处方比例的空白辅料适量于25 mL量瓶中,加流动相少许使其溶解,用流动相稀释至刻度,摇匀;滤过,精密量取续滤液2 mL置于10 mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液,按上述色谱条件进样 20 μL,记录色谱图,结果平均回收率为100.2%,RSD为0.98%,见表4。

2.3.5 重复性试验

精密称取本品一批(批号:09001-1)约32 mg 6份,按含量测定项下方法配制,按上述选定的条件测定,结果平均含量为 96.87%,RSD=0.62%,结果表明重复性良好,见表5。

表4 胞磷胆碱钠片含量测定回收率试验

表5 胞磷胆碱钠片重复性实验

2.3.6 稳定性实验

取供试品溶液一份于室温下放置,按上述选定的方法,在0,2,4,6,8 h分别进样测定,结果以峰面积计RSD为0.21%。结果表明,样品溶液在8 h内稳定,见表6。

表6 胞磷胆碱钠片含量测定稳定性试验

2.3.7 样品含量测定

2.3.7.1 对照品溶液的配制

精密称取以五氧化二磷为干燥剂,在100℃减压干燥5 h的胞磷胆碱钠对照品16 mg两份分别置于200 mL的容量瓶中,加流动相磷酸二氢钠溶液适量,摇匀使溶解,加流动相至刻度。

2.3.7.2 供试品溶液的配制

取本品10片,研细,精密称取细粉约32 mg(约相当于胞磷胆碱钠20 mg),置于50 mL量瓶中,加流动相磷酸二氢钠溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过;精密量取续滤液2.0 mL,置于10 mL容量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。

照上述选定的方法分别取供试品溶液和对照品溶液进样20 μL进行测定,结果平均含量分别为96.10%,96.60%,95.80%,见表7和图2所示。

表7 胞磷胆碱钠片含量测定试验

图2 胞磷胆碱钠片含量测定HPLC图

3 结 语

1)检测波长的选择。取胞磷胆碱钠对照液及其辅料空白液在350～230 nm波长范围内作紫外光谱扫描,对照液在271 nm波长处有最大吸收,而辅料空白液在此波长范围内渐近无吸收,故选择检测波长为271 nm。

2)高效液相色谱仪测定胞磷胆碱钠含量曾选用不同比例的甲醇-水为流动相,但胞磷胆碱钠保留时间太短,理论板数不够理想,经查阅大量文献和试验,最终采用0.025 mol/L磷酸二氢钠水溶液为流动相。

3)所测物质均为碱性物质,采用中性流动相(水或水-甲醇)均无法达到较好分离,采用偏酸性的磷酸盐缓冲液作为流动相,改善了拖尾现象,得到了较好分离。

4)通过对胞磷胆碱钠片进行高温、高湿、光照条件下的加速破坏研究,结果表明,无新的杂质产生,主峰与杂质峰分离度良好。

[1]国家食品药品监督管理局国家药品标准.WS 1-(X.608)-2002Z-2008[S].

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