天然抗氧化植物化学物的研究进展

陆奕娜

（汕头出入境检验检疫局，广东 汕头 515031）

体内氧自由基的产生和清除在正常情况下应当是平衡的。如果由于某些原因，使得体内产生的氧自由基过多，或者体内防护、清除和修复能力下降，体内就会出现氧自由基代谢的失衡，就会导致自由基损伤，引起疾病的发生。

大量研究发现，膳食中富含一些植物化学物，它们能够清除自由基，保护机体，抵抗疾病。据文献[1]报道大约90%的癌症都与环境因素有关，其中1/3死于癌症的美国人实际上可通过改变膳食习惯而加以避免。正因为这些研究的发现，使功能性食品和天然健康食品迅速受到消费者的关注，同时也成为研究与开发的热点。

1 抗氧化活性的评估

现在已经建立了许多对抗氧化活性评估的体外评估和体内检测模型。

1.1 光化学发光（Photochemiluminescence，PCL）法

光化学发光（PCL）法是使用具有光化学激发作用的光敏剂（photoscnsitizer，发光氨）激发反应分子，使之在紫外灯的作用下以比正常条件下快1000倍的速度发生氧化反应，迅速生成自由基。自由基与样品中的抗氧化剂发生反应后，用专门的检测仪器——超快速抗氧化剂和自由基全自动分析仪对剩余的自由基进行测定，从而检测出抗氧化剂的抗氧化能力。该方法能够快速、准确、直接、全面地测定基质中的综合抗氧化能力。

Tsao[2]等选取几种多酚类抗氧化剂以及植物提取物作为研究对象，用PCL法检测了它们的抗氧化活性，研究结果发现，PCL法确实能够快速、准确地检测出抗氧化剂的抗氧化活性，并且能够通过信号图直观地看出几种物质之间抗氧化活性的差异。

由于光化学发光法中所用到的分析仪器价格昂贵，在国内应用此法对抗氧化剂的研究鲜有报道。

1.2 抗氧化剂还原铁能力（Ferric reducing antioxidant power，FRAP）法

FRAP用来测量总抗氧化活性。它的原理是通过Fe3＋-TPTZ（Fe3＋-ferric tripyridyl-s-triazine）被样品中的还原物质还原为Fe2＋-TPTZ的形式，该物质呈现出蓝色，并在593 nm波长处有最大吸收峰。吸收值越大，说明待测植物化学物的抗氧化活性越高。

郭长江等[3]通过FRAP法对36种蔬菜和30种水果的抗氧化活性进行了测定比较。

1.3 β-胡萝卜素－亚油酸模型系统（β-CLAMS）

β-CLAMS的原理是在高温条件下，亚油酸在氧化过程中会产生过氧化物及游离的自由基，这些过氧化物及游离的自由基会引起β-胡萝卜素褪色（该物质在490 nm波长中有最大吸收），通过测定加入的抗氧化剂对β-胡萝卜素褪色的抑制情况，可判断出该抗氧化剂的抗氧化活性的强弱。β-CLAMS就是根据这个原理建立起来的一套评估抗氧化活性的模型系统。

洪庆慈等[4]以β-胡萝卜素－亚油酸法测定了8种粮食材料提取物的抗氧化活性，他们的实验结果表明，大麦籽和燕麦籽的石油醚提取物都有较高的抗氧化活性，而稻壳和花生壳的石油醚提取物只有微小的抗氧化活性。而8种粮食的甲醇提取物都具有一定的抗氧化活性，其中以花生壳、稻壳和黄豆壳提取物的抗氧化活性比较强。

1.4 氧自由基吸收量（Oxygenradical absorption capacity，ORAC）法

ORAC检测法用来检测水溶性植物化学物抗氧化能力的一种方法。该方法以藻红蛋白（phycoerythrin，PE） 作为指示蛋白，AAPH[2，2’-azobis（2-amidino-propane)dihydrochloride]作为ROO·自由基的发生物，当上述2种化合物混合后，PE在AAPH释放的ROO·攻击下，一定波长下的荧光强度不断衰减，直到降至本底水平，由于不同的抗氧化剂清除自由基的能力各不相同，因此加入上述体系后对PE的保护也不同，最后根据PE荧光强度衰减曲线下面积计算被测试样的抗氧化能力。

郭长江等[5]用ORAC法对9种坚果类食品的抗氧化活性进行了测定，并与FRAP法进行了比较，结果发现用ORAC法测定的结果与FRAP法测定的结果差异显著，但高度相关（r=0.9754，P<0.01），提出在进行抗氧化研究时应注意2种方法的差异。

1.5 Trolox等价抗氧化剂能力（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）法

该法以ABTS＋[2，2’-azobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate)]为自由基源。由ABTS与亚铁肌红蛋白的相互作用或者三价铁肌红蛋白与过氧化氢（H2O2）反应产生自由基。通过在734 nm波长处ABTS自由基淬灭后吸收值与Trolox—一种水溶性VE类似物作比较来衡量待测抗氧化剂的抗氧化能力。

在实际应用中，如采用该种方法则需要较长时间，而且，ABTS＋会随着时间变化而变化，这样会对测量结果造成不利影响。韩光亮等[6]对ABTS＋法进行改良，通过在酶标板上以Trolox为标准对照，测定抗氧化物质对预先制备的自由基ABTS＋的清除能力，再用不同浓度的乙醇和重亚硫酸钠为提取液，在不同的温度、不同的溶剂/水果比条件下，提取水果黑醋栗（Black curran）中的抗氧化活性物质。结果表明，改良后的ABTS＋法测定物质的抗氧化活性，方法简便可行，也可用于对抗氧化物质大规模的筛选。

1.6 二苯代苦味肼基自由基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）法

DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，呈紫色，在517 nm有强吸收。当有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而这二者呈线性关系，即抗氧化能力越强吸光度下降值越大。而对于同种抗氧化剂来说，浓度越大，清除DPPH程度越强。对于不同的抗氧化剂，可根据清除50%原始DPPH浓度所需抗氧化剂量（EC50）的大小来比较其抗氧化能力。

丰永红等[7]用DPPH法测定了甘蔗制糖过程中各种原料的抗氧化活性，同时探讨了pH、加热温度、加热时间对自由基清除率的影响。他们的实验结果表明，各种原料均具有较强的抗氧化活性；pH对抗氧化活性影响很大，而加热时间和温度对抗氧化活性无显著影响。初步推断该活性物质属多酚类化合物。

1.7 硫代巴比妥酸反应物值（Thiobarbituricacidreactive substance，TBARS）法

硫代巴比妥酸反应物（TBARS）值法是评价油脂的氧化程度最常用的方法。氧化的油脂多生成丙二醛，一分子的丙二醛可同两分子的硫代巴比妥酸作用生成有色化合物，该有色化合物在530 nm左右有吸收。因此，可通过测定丙二醛的量来评价油脂的氧化程度，也可测定抗氧化剂的活性。

胡博路[8]也用TBARS法测定了翅碱蓬（suaeda heteroptera）提取物的抗氧化作用。实验表明，翅碱蓬的水、甲醇、正己烷提取物对亚油酸脂质过氧化均有良好的阻断作用，其中以正己烷提取物阻断能力最强。他还用同种方法[9]测定了核桃壳的抗氧化作用。核桃壳能有效地抑制脂质过氧化，其正己烷、乙酸乙酯提取物抑制脂质过氧化的效果可与茶多酚相媲美。

1.8 体内抗氧化评价方法

体内抗氧化评价方法包括DNA、蛋白质以及线粒体氧化损伤检测方法[10]。

目前对DNA氧化损伤的检测可分为直接和间接两方面的检测，直接检测DNA损伤比较常用的方法是测量DNA单链断裂，目前广泛应用单细胞凝胶电泳法（SCGE）。间接检测DNA氧化损伤较常用的指标是测定血清与尿中8-羟基脱氧鸟苷。正常情况下，8-羟基脱氧鸟苷在DNA修复机制的作用下被及时切除，形成8-羟基脱氧鸟苷随尿液排出体外。所以血清与尿中8-OH-dG可作为DNA氧化性损伤的分子生物学标记物。目前有酶联免疫吸附（ELISA）法、P后标记法、气质联用分析法（GC2MS）、PY共振光散射法等[11]。

针对蛋白质的抗氧化保护检测方法都是检测抗氧化剂对蛋白质氧化损伤生成的羰基清除作用。蛋白质在细胞内分布广泛，它的氧化损伤对细胞生理至关重要，检测时要加入二硝基苯肼（DNPH），再使用分光光度法或者使用酶联免疫吸附法（ELISA）测定蛋白质羰基生成，来衡量蛋白质的氧化损伤情况。然而蛋白质的氧化损伤特异性物质可能不是羰基，现在认为是3-硝基酪氨酸。目前主要采用免疫组织化学、高效液相色谱、气相色谱等。闫莉[12]等通过试验建立了双抗体夹心ELISA法快速测定3-硝基酪氨酸，试验平均回收率为100.57%。

粒体的抗氧化活性检测可以采用脂质过氧化检测方法、线粒体肿胀度、线粒体中ATP酶活性等，对应的方法有硫代巴比妥酸（TBA）、分光光度法、定磷法等。实验中必须精确分离线粒体膜，保证膜功能完整，尽量模拟出在细胞内的真实情况。

2 有效成分的提取

天然植物中的成分十分复杂且有些物质含量甚微，提取时又要求活性因子不能被破坏，溶剂萃取等传统提取方法已远远不能满足对天然植物进行深入研究的需要。如何快速、有效地将活性因子提取出来以及对提取物进一步分离纯化成为许多该方面工作者研究重点。

2.1 传统溶剂提取法

溶剂提取法分为浸提法、溶剂萃取法。根据提取效果符合相似相溶的原则，浸提法所选用的溶剂应该视被提取物的极性强弱而定。溶剂提取法具有应用范围广、仪器设备简单、操作容易等优点。

乙醇和水是最为常用的提取溶剂，这是考虑到它们的卫生和来源的丰富。因此，极性抗氧化剂如酚酸和许多黄酮的甙类物质通常都会用水、乙醇或者乙醇和水的混合物来提取。张怀珠等[13]采用单因素及正交试验设计，对荞麦粉中黄酮类化合物的最佳提取工艺进行了初步研究。结果表明，在60℃条件下，用15倍的乙醇（65%）浸提3 h，提取效果最佳。

2.2 微波辅助提取法（microwave-assisted extraction，MAE）

MAE是一种利用微波技术与传统溶剂提取法相结合的新的提取技术，利用不同结构的物质在微波场中吸收微波能力的差异,某些组分被选择性加热,从而使被提取物质从基体或体系中分离。在MAE中，为了使提取溶剂达到最佳的介电系数，通常会加入水或者其它一些极性较大的溶剂来作为改良剂[14]，因为具有高的介电系数（极性）的溶剂能够吸收更多的微波能，从而提高提取的效果。主要优点是[15]：①可有效保护功能成分,对提取物具有较高的选择性,提取率高。②浸出过程中材料细粉不凝聚、不糊化。③提取速度快、省时、溶剂用量少。④安全、节能、设备简单、节省投资。

郭振库[16]等用微波提取法提取黄芩中黄芩苷，结果发现微波法提取不仅所需的时间短，平行性好，而且提取率比超声波提取法高将近10%。

2.3 超临界萃取法

处于临界点附近的超临界流体对溶质具有独特的溶剂优点，不仅对溶质具有极高的溶解能力，而且通过改变温度或压力就可容易地改变对溶质的溶解度，从而达到选择性地萃取、分离化合物。

在食品、香料、化妆品、医药工业的超临界流体萃取技术中，CO2为萃取剂的超临界萃取显示了独特的优点，具有温度与压力较低、稳定性好、无污染、易分离等优点。白英[17]等研究了在超临界状态下，不同的萃取压力、萃取温度、CO2流量和萃取时间对胡萝卜中β-胡萝卜素萃取效果的影响。结果表明：胡萝卜中β-胡萝卜素的CO2超临界适宜萃取条件为：萃取压力40 MPa，萃取温度40℃，CO2流量5 L/h，萃取时间90 min。在此条件下，提取率为6520μg/100 g。4个因素中，对提取率影响大小依次为压力>时间>温度>流量，且在最适条件下，超临界CO2萃取效果均优于有机溶剂。

2.4 超声提取

超声波具有3大效应：机械效应、空化效应和热效应[18]。机械效应能够强化介质的扩散和传质的效果；空化效应则会造成植物细胞壁及整个生物体在瞬间破裂，释放出有效因子；热效应的效果是导致介质本身和待萃取成分温度升高，增大了有效成分的溶解度，并可使被提取成分的生物活性保持不变。此外，超声波的一些次级效应，如乳化、扩散、击碎等也促进了植物中有效成分的溶解、扩散和与溶剂的充分混合。超声提取技术与常规溶剂提取法相比，具有不需加热，耗时短、提出率高，不影响有效成分的生理活性，适于热敏性物质的提取等优点。

王立升等[19]研究小叶榕叶提取黄酮类成分试验，优选了工艺参数：乙醇浓度60%，料液比1∶30，提取时间20 min，功率为240 W。在该工艺下,小叶榕叶中总黄酮的提取率达到4.38%，高于传统热提取法。

2.5 酶解技术

大部分植物化学物往往包裹在细胞壁内，选用适当的酶作用于植物材料，如水解纤维素的纤维素酶、水解果胶质的果胶酶等，可以使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素、果胶质等物质降解，破坏细胞壁的致密构造，从而有利于有效因子的溶出。另一方面，通过选择适当的酶类，可以有效地使目标物溶出，同时控制非目标物的溶出，在提高溶出效率的同时，为后续的提取液的精制创造有利条件。

王敏等[20]介绍了一种对苦荞茎叶中黄酮类物质的方法——酶水解法，总黄酮得率可达1.47%，在相同的温度、pH和处理时间下，总黄酮得率为未酶解样品的3.08倍。

2.6 加压液体萃取法（pressurizedliquid extraction，PLE）

PLE也称加速溶剂萃取法（accelerated solvent extraction，ASE），PLE是将样品放在密封容器中，加热到高于溶剂沸点的温度（通常50℃～200℃），引起容器中压力升高，同时给予一定压力使溶剂不发生气化，从而大大提高萃取速度，实现了高温、高压条件下的萃取。PLE的优点在于溶剂用量少，萃取时间短，回收率、精度与索氏提取相当[21]。

PLE在天然植物活性成分提取中的应用最早开始于Benthin等的工作[22]，后来，PLE在国外被相继应用于植物中黄连素[23]、人参皂苷[24]的提取。

2.7 双水相提取法（Aqueoustwo－phaseextraction，ATPE）

双水相萃取技术（ATPE）属于液－液萃取，分离原理是物质在双水相体系中的选择性分配。该法设备投资少,操作简单,无有机溶剂残留污染。由于双水相体系分相快，使用温度低，容易操作，无污染，提取率高，因此成为黄酮化合物富集分离的一种有效方法。

张春秀等[25]采用双水相萃取法对银杏叶浸出液中黄酮类化合物进行萃取，具有萃取温度低，时间短，且分相速度快的优点，萃取率可达98.2%，高于溶剂萃取的萃取率。

3 分离纯化方法

3.1 常规色谱法（Conventional chromatography）

纸色谱，填充柱和薄层层析常用于许多抗氧化植物化学物的分离和纯化。然而，由于欠缺良好的分离效果和分辨度，而且在检测、定量分析和灵敏度方面都存在着难以优化的困难，所以这些常规色谱技术，特别是纸色谱法，已经不像以前那样应用广泛了。而填充柱和薄层层析由于其设备简单且对操作技能要求低等特点，在植物化学物的分离方面的应用仍有报道。

李剑明[26]等对姜黄抗氧化成分及性能进行测定，应用柱色谱法获取了3种色素单体并用薄层层析法对各成分进行纯度鉴定，实验结果发现通过柱色谱法可获取纯度很高的多种色素单体。

3.2 气相色谱法（Gas chromatography，GC）

气相色谱法是采用气体作为流动相的一种色谱法，具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、操作简单等优点，适合于分离具有挥发性且热稳定的抗氧化植物化学物。可是，大多数来自于植物中具抗氧化活性的植物化学物如β-胡萝卜素、酚酸和黄酮等都是不易挥发且热不稳定的物质。因此，GC在对植物化学物分离的应用上远比不上高效液相色谱法（HPLC）[2]。

3.3 高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography，HPLC）

高效液相色谱法是20世纪70年代急剧发展起来的一项高效、快速的分离分析技术。在经典的液体柱色谱法的基础上采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化。其优点除了分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等以外，最重要的是样品不需要经过气化处理，因此不受样品挥发性的限制，有利于对具有难挥发和热不稳定特点的植物抗氧化剂进行分离分析，应用相当广泛。

3.3.1 HPLC在类胡萝卜素抗氧化剂分离中的应用

适用于类胡萝卜素的HPLC分析方法的吸附剂溶剂系统分3类：（1）正相：采用以硅胶为固定相的正相色谱法有利于其顺反非对映体的分离，但却不利于α－及β－位置异构体的分离，而且作为分离柱填料的硅胶还促使类胡萝卜素的降解，因此逐渐被反相分离方法所取代。（2）反相等度：这种系统的色谱柱常使用结合有十八碳硅烷的氧化硅作为填充剂。该系统一般能较好地分离维生素A原类胡萝卜素，但分离叶黄素的效果较差。王强[27]报道了利用该系统成功地分离了多种类胡萝卜素。（3）反相梯度：在反相柱上运用梯度洗脱能够成功地分离多种类胡萝卜素[28]。这种系统能够分离烃基胡萝卜素、叶黄素及叶绿素等，还能从类胡萝卜素母体化合物中分离出顺式异构体及氧化产物。由于该系统能够精确地分离各种类胡萝卜素及其异构体，最有希望成为分析类胡萝卜素的应用系统。

3.3.2 HPLC在黄酮类抗氧化剂分离中的应用

利用高效液相色谱测定黄酮类物质一般都是用反相柱，柱的长度约为100 mm～300 mm，内径约为4.6 mm。固定相经过处理后可提高柱的分离效能，如固定相连接β－环状糊精可用来分析鉴定黄烷酮糖苷的对映体。目前已有不需前处理而直接对黄烷酮对映体和非对映体进行分离的文献报道[29]。张平安等[30]研究了利用反相HPLC法测定银杏叶及其提取物中总黄酮的方法，银杏叶样品经提取水解处理后使用等度洗脱，反相HPLC分离，根据保留时间定性，混合外标定量。结果表明，反相HPLC法的准确度高，能满足银杏叶及其提取物中总黄酮的测定，具有很广的实用性。

3.4 高速逆流色谱法（High-speed counter-current chromatography，HSCCC）

HSCC是20世纪80年代由美国Ito博士发明的一种新的逆流色谱技术。它是基于液－液分配原理，利用螺旋管的方向性与高速行量式运动相结合，产生一种独特的动力学现象，使两相溶剂在螺旋管中实现高效地接触、混合、分配和传递，具有分离效率高、超载能力强、溶剂用量少、无气相色谱中固体载体的吸附现象，应用范围广，特别适用于极性化合物的分离。逆流色谱在天然产物分离与制备领域应用较多[31]。目前,已成功地开发出分析型和制备型高速逆流色谱仪[15]。

据文献报道，HSCCC已在生物碱、黄酮、萜类、木脂素、香豆素等成分的研究中获得成功。佘佳红等[32]提出用HSCCC分离分析白果内酯的简便方法。

3.5 超临界流体色谱法（Supercritical fluid chromatography，SFC）

超临界流体色谱法（SFC）是利用超临界流体为流动相，具有穿透力强，提取率高，不破坏样品，不需要回收溶剂的分离分析技术。更重要的是它既可分离GC不适应的高沸点、低挥发、热不稳定的样品，又比高效液相色谱HPLC有更快的分离速度和更高的柱效率[31]。SFC已广泛用于天然抗氧化植物化学物的提取，并与气相色谱、红外、质谱等技术联用，形成了更为有效的分离分析技术。

齐国鹏，赵锁奇[33]采用SFC法以超临界CO2作为流动相，携带剂为乙醇或正己烷，考察了番茄红素及其氧化产物在C18色谱柱上的保留值的变化规律，确定了最佳的分离条件，结果的重复性和平行性较好。

3.6 膜分离法（Film separation）

膜分离法主要有超滤、微滤、纳滤和反渗透等，这种方法操作简便，不需要加热，不损坏化合物，提取效果好，超滤装置可反复使用。于涛等[34]研究了银杏叶中黄酮类化合物的提取过程及工艺，使用超滤技术对粗提的产品进行精制，对影响超滤的工艺条件进行了考察，超滤后产品中黄酮质量分数达到33.99%。

3.7 高效毛细管电泳法（High performance capillary electrophoresis，HPCE）

HPCE产生于20世纪80年代后期，它是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。在高压作用下，带电粒子在毛细管内的溶液中迁移，迁移速度等于电泳和电渗流的矢量和[35]。与常用的HPLC相比，具有分析时间短、分离效率高、适应性广、检测限低、进样量少、溶剂消耗少、自动化程度高和运转费用低等优点，所以已成为目前色谱领域中发展较快的一个分支，并且在生命科学、生物技术，医药等领域显示了极好的应用前景[31]。

随着电泳技术的发展，以毛细管区带电泳（CZE）、胶束电场毛细管电泳（MECC）、毛细管等速电泳（CITP）、毛细管凝胶电泳（CGE）、毛细管等点聚焦（CIEF）等为代表的HPCE分离模式大大拓展了分离纯化的运用范围。Tao[36]等用CZE成功分离了苷草根中的黄酮类化合物。Marek[37]等采用CITP和CZE在线联用法分离并测定了金丝桃类植物的叶或花的甲醇提取物中的芦丁、异栎素、栎素等黄酮类化合物。

4 结论

近几年，人们热衷于对影响人体健康的诸多因素进行研究，自由基与抗氧化剂更是其中的热点。随着对自由基作用机理以及对人体健康影响的不断深入了解，人们开始了寻找对抗自由基的有力武器——抗氧化剂的征程，从VC、VE、人工合成抗氧化剂BHA和BHT，到从天然产物中提取分离具有抗氧化性的植物化学物，如多酚类和类胡萝卜素类等。天然抗氧化植物化学物来源广，副作用小，其“药食同源”的优势符合现代营养免疫学理念，具有无限的开发前景和广阔的需求市场。本文尝试通过植物化学物抗氧化活性的评估、提取和分离3个方面来介绍近年来对植物化学物的研究进展，涵盖了各种方法的优势、应用以及所取得的成果，希望给从事这方面研究的读者提供一些参考。随着植物化学物抗氧化活性的评估、提取和分离技术的进一步开发并规模化，人们的健康水平有望提升至一个更高的水平。

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