糖皮质激素性股骨头坏死骨组织OPG、RANKL、MMP-1、MMP-2、TIMP 的表达变化及意义

王佳斌，艾江平

(三亚市人民医院，海南三亚572000)

长期大剂量使用糖皮质激素的患者有可能出现激素性股骨头坏死，这在非创伤性股骨头坏死原因中位居第一［1，2］。骨保护素(OPG)和破骨细胞分化因子(RANKL)作为破骨细胞分化和调节骨吸收的关键因子，可直接影响破骨细胞功效，是骨质吸收的共同通路［3，4］。基质金属蛋白酶(MMP)及基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)主要影响机体各种组织的发育和修复。本研究观察了长期应用糖皮质激素致股骨头坏死患者骨组织中OPG、RANKL、MMP-1、MMP-2、TIMP的表达变化，探讨糖皮质激素性股骨头坏死的发病机制。

1 资料与方法

1．1 临床资料 2009年1月～2010年3月在本院接受手术治疗的自愿捐赠股骨头骨组织及骨髓的股骨颈骨折患者29例(对照组)及长期应用糖皮质激素(大剂量糖皮质激素冲击治疗超过1周，发病时正在接受糖皮质激素治疗超过3周或2 a内接受糖皮质激素治疗)致股骨头坏死患者30例(研究组)。对照组男18例、女11例，年龄43～68岁。研究组男20例、女10例，年龄42～67岁，排除酒精性、减压病等原因造成的股骨头坏死。本研究经本院伦理委员会讨论后批准。

1．2 标本采集及处理 对照组用小刮匙收集术中取出的股骨头松质骨，研究组小刮匙或骨穿针取股骨头松质骨，置4%多聚甲醛溶液固定。从两组患者大粗隆穿刺抽取骨髓10 ml，肝素抗凝，采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞(BMSCs):骨髓液中加高糖DMEM培养液，离心后弃上清，收集细胞;按1×109/L的标准接种于含15%FBS的高糖DMEM培养液，37℃、5%CO2培养箱培养;2 d后更换培养基，至培养第8～10天，收集BMSCs。

1．3 BMSCs中OPG、RANKL mRNA的检测 采用RT-PCR技术。根据目的基因在Genbank中的己知序列，采用Primer5．0软件自行设计引物，参照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，合成cDNA第1链，进行PCR。通过 ABIprism 7300SDS软件计算 OPG、RANKL mRNA的相对表达量。

1．4 股骨头松质骨中MMP-1、MMP-2、TIMP蛋白的检测 采用免疫组化SABC法。骨组织石蜡切片，微波修复抗原，PBS冲洗。滴加正常山羊血清，封闭液，室温20 min;滴加Ⅰ抗，4℃过夜后PBS冲洗;滴加生物素化二抗(羊抗兔IgG)，PBS冲洗;滴加试剂SABC，PBS冲洗。DAB显色，蒸馏水冲洗。苏木素复染，盐酸乙醇分化。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片，光学显微镜观察。MMP-1、MMP-2、TIMP蛋白定位于骨细胞胞质和胞膜上，呈棕黄色颗粒;取其光学显微镜图像，通过Image-Pro Plus7．0分析软件对图像进行分析，每张切片均采用5个图像测定阳性表达产物的积分光密度值(IOD值)，取均值，IOD值越大表示阳性产物表达越强。

1．5 统计学方法 采用SPSS17．0统计软件。计量资料比较用t检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

研究组BMSCs的OPG mRNA相对表达量为0．43 ±0．12、RANKL mRNA 为 1．48 ±0．32，对照组分别为0．72 ±0．05、0．96 ±0．43，两组相比，P 均＜0．05。研究组骨组织中 MMP-1、MMP-2、TIMP 蛋白的 IOD 值分别为 329．43 ± 75．54、324．53 ±65．53、68．32 ± 18．85，对照组分别为 189．42 ±25．58、145．43 ±25．76、275．23 ±48．43，两组相比，P均 ＜0．05。

3 讨论

在无菌性股骨头坏死的病因中，最主要的因素为长期糖皮质激素的应用。糖皮质激素性股骨头坏死的发病主要与血管内凝血、脂质代谢紊乱、股骨头内高压、基因表达异常及骨质疏松等有关。

RANKL主要由成骨细胞前体及成骨细胞表达，通过旁分泌方式与其受体结合，促进破骨细胞的生成和活化。OPG在骨组织中为RANKL的受体，能够与RANKL结合，而阻止RANKL与RANK的结合，进而阻止了破骨细胞的生成和活化［5］。本研究结果显示，研究组BMSCs的OPG mRNA较对照组降低、RANKL mRNA较对照组增高，这将有利于破骨细胞的生成及其活性的提高，使骨吸收加剧。这可能是激素性股骨头坏死的发病机制之一。

MMP及其特异性抑制因子TIMP参与降解各种组织细胞外基质。MMP-1、MMP-2是骨吸收过程中降解骨基质有机物成分(如Ⅰ型胶原)的主要蛋白酶。研究［6，7］表明，MMP-1、MMP-2 分泌增多和(或)TIMP分泌减少，将促进骨基质的降解。本研究结果显示，与对照组相比，研究组骨组织中 MMP-1、MMP-2蛋白的表达明显增强，而TIMP的表达则明显减弱，这将会造成骨组织的破坏。这可能也是激素性股骨头坏死的发病机制之一。

总之，长期应用糖皮质激素导致的股骨头缺血性坏死可能与OPG/RANKL、MMP/TIMP系统的平衡失调有关。糖皮质激素可能直接或间接破坏OPG/RANK、MMP/TIMP系统的平衡，上调破骨细胞活性，加速骨细胞凋亡和骨基质降解，促进骨吸收，导致股骨头缺血性坏死;或通过导致骨质疏松症，使股骨头不能承受正常压力负荷、局部凝血异常而缺血坏死［8］。

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