组织脱细胞方法的研究进展

孙 亨 综述 王艳霞 吴 江 审校

1（四川大学 华西基础医学与法医学院，成都610041）

2（四川大学 图书馆，成都610041）

1 介绍

在医学研究中，寻找可替代的生物材料一直是一个热门话题。尤其对于移植的组织来源，若是使用自体的组织，则组织的量和可取的部位都十分有限；若是来源于异体组织，则免疫反应可能会造成十分严重的后果。因此，寻找不会产生免疫反应的异体组织来源，成为研究的一个方向。经过脱细胞的组织，能够很大幅度降低免疫反应，是作为组织工程和再生医学应用的理想材料。

脱细胞的方法很多，也会根据组织和器官的不同而改变。根据脱细胞方法性质的不同，可以大体上将其分为物理、化学和酶学方法，每种方法对组织的作用不同，清除细胞的成分和效率不同，对剩下的细胞外基质支架的影响也不同。这些差异反过来也会影响移植后宿主对生物材料的反应。

2 脱细胞的基本原理

从组织中脱细胞可以分离出由结构蛋白和功能蛋白组成的复杂混合物，即细胞外基质（Extracellu－lar Matrix，ECM）。异种和同种异体的细胞抗原会被宿主识别为异物，因此会使组织产生炎症反应和免疫排斥。但ECM却不会产生以上反应，即使是异种来源，它也能被宿主很好地接受。脱细胞的目的就是要有效地去除组织中所有的细胞成分，同时使其对ECM化学组成、生物活性和机械特性的副作用最小化。

组织脱细胞最常用的方法是物理化学结合的方法。物理方法包括机械搅拌、冻融法、加压、超声处理等。这些方法会直接破坏细胞膜，使细胞内容物释出。但仅仅使用物理方法还不能达到脱细胞的目的，还需要借助化学方法来清除被破坏的细胞成分。比如使用各种洗涤剂，抑或是酶处理来溶解细胞碎片。也可以直接使用化学或酶学方法来进行脱细胞［2，6］，不过各种洗涤剂和酶作用的成分都有差异，往往需要多种试剂合用来达到脱细胞的目的，脱细胞过程的处理时间也较长［4］。有的ECM在处理过程中必须被破坏，这样才能使细胞充分暴露于洗涤剂中，从而使细胞能更有效率地被清除。特别是较厚的组织，深处的细胞往往不能与洗涤剂充分接触，因而脱细胞的效果不甚理想。大多数脱细胞处理都想尽可能减少对ECM的破坏，从而保持ECM原有的机械特性和生物特性。

3 脱细胞方法

最常用、最有效的脱细胞方法可以分为物理、化学和酶学方法。通常先使组织细胞的细胞膜溶解，再将细胞成分和ECM分离，溶解细胞质和细胞核，最终清除组织中的细胞碎片。第一步可以使用物理、化学和酶学方法完成，而后面几步通常使用化学和酶学方法完成。在处理的过程中，可以与机械搅拌配合来增强化学和酶学试剂的作用。在脱细胞之后，所有残留的试剂都必须被清除，以防止这些化学物质与宿主起反应。脱细胞和保留ECM的效果可以用多种方法进行评估［7，8］。下面将对各种组织脱细胞方法进行回顾。

3.1 物理方法

可以用来进行脱细胞处理的物理方法有冷冻、超声处理、加压、搅拌和射线等。

3.1.1 速冻和冻融法 速冻法已经在与肌腱和韧带［10］有关的组织和神经组织［11］的脱细胞中使用。近来也有人在其他组织上使用，如血管［45］和拟胚体［9］。通过反复冻融的方法，能提高脱细胞的作用［9，45］。快速冷冻组织后，细胞内冰结晶形成，破坏细胞膜，从而导致细胞溶解。为了避免冰结晶对ECM造成破坏，温度变化的速率必须受到精确的调控。在破坏了细胞结构后，还需要洗涤剂将细胞碎片等清除。

3.1.2 加压法 采用对组织直接加压的办法能让细胞被直接破坏，但这种方法仅对ECM非紧密排列的组织或器官有效（比如肝、肺）［1］。最近，Funamoto等使用超高压（高静水力学加压法High－hydrostatic pressurization，H HP或超高压静水力学加压法Ultrahigh hydrostatic pressurization，UHP）的方法对血管、角膜等进行脱细胞，取得了很好的效果［3－5，12］。在一定的温度下，将组织浸于含葡聚糖的磷酸缓冲液PBS中，逐步加压至约980 MPa，持续约10分钟。完成后，再使用洗涤剂脱去残留的细胞成分。这种方法简便快速，脱细胞的效率也很高，但高压对ECM的影响还没有完全研究清楚。已经有研究证明了高压对蛋白质的变性作用［13，14］，但其对胶原的具体作用研究还十分有限。另外，由于压力变化会改变水的溶点，高压使水溶点上升，因此在进行加压处理的过程中可能会产生冰结晶从而对ECM造成破坏。所以在处理的过程中需要对温度和压力上升速率等进行控制。已经有报道证明H HP能破坏细菌、真菌和有包膜病毒的磷脂双分子层，这说明H HP处理具有灭菌的作用。当压力大于600 MPa时，就可以让细菌和有包膜病毒失活［15］，因此980 MPa的高压已经足够保证其灭菌效果。

另一种基于加压的物理脱细胞方法是对流脱细胞法（Convective flow decellularization）。对于血管等组织，通过对流加强管壁压力来达到脱细胞的目的。这种方法能有效去除可溶性蛋白，甚至包括难以检测到的蛋白。不过，过高的压力反而可能降低脱细胞的效果，这可能是因为持续高压使管壁ECM更加紧密，减少了孔隙，无法直接脱去细胞［7］。

3.1.3 放射法 通过射线可以破坏细胞，降低其抗原性。可以将射线和其他化学洗涤剂一起使用［16］，也可以用来对特殊组织进行处理，比如神经细胞。X射线可以杀死施万细胞（Schwann cell），破坏其分泌抗生素原物质的功能，又能通过保留的神经膜管结构支架使周围神经得以再生。大剂量的放射线照射能降低异体神经细胞的免疫原性，但是否会损坏组织形态尚有争议［46］。

3.1.4 机械搅拌和超声处理 机械搅拌和超声处理与化学方法同时使用可以用来帮助细胞的溶解和细胞碎片的清除。现在还没有研究来确定使用超声破坏细胞的最佳频率，不过一台标准的超声清洁机已能够有效清除定轨摇床上放置的组织中的细胞成分［1］。

3.2 化学方法

3.2.1 酸碱处理 酸碱可以使细胞质成分溶解和破坏核酸，比如乙酸、过氧乙酸（Peracetic acid，PAA）、透明质酸、硫酸和氨水等，可以有效破坏细胞膜和细胞器［17，18］。但是这些化学物质也能破坏许多其他分子如糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG），后者是ECM的重要成分之一。

许多猪的组织，包括小肠粘膜下层（Small intestinal submucosa，SIS）和膀胱粘膜下层（Urinary Bladder Submucosa，UBS），已经使用0.10～0.15%（w／v）的PAA成功脱细胞。在经过PAA处理后，ECM中仍然含有许多原有的GAG包括透明质酸、肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素A和硫酸皮质素等［19］，还有层粘连蛋白和纤维连接蛋白［20］。不仅如此，在处理后还保留了很多驻留在ECM中的生长因子，包括转化生长因子β（Transforming growth factorβ，TGF－β），碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，BFGF）和血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）［21，22］。而在生物支架的机械特性上，PAA处理没有发现任何副作用［18］。

3.2.2 非离子洗涤剂 非离子洗涤剂已经被广泛应用到各种脱细胞方案中，因为它们对组织结构的反应相对比较温和，脱细胞效率也较高。非离子洗涤剂破坏脂质之间和脂－蛋白之间的相互作用，却不破坏蛋白之间的相互作用，所以组织经非离子洗涤剂处理后，其中的蛋白仍能具有功能构象［23］。

曲拉通（Triton）X－100是脱细胞方案中研究最广泛的非离子洗涤剂。使用Triton X－100脱细胞的结果会根据组织的不同而不同。当Triton X－100用于心脏瓣膜的脱细胞时，经过24小时的处理，可以使核物质完全被清除而保持瓣膜结构；但是对于旁边的心肌和主动脉壁，它却不能很好地清除细胞［24］。对于瓣膜的ECM，Triton X－100导致几乎所有GAG丢失，也减少了层粘连蛋白和纤维连接蛋白含量［24］；不过在前十字韧带（Anterior cruciate ligament，ACL）的脱细胞中，被Triton X－100处理4天的硫化GAG却没有变化［25］。Triton X－100对细胞质和细胞壁的清除作用较好，而对细胞核的清除能力较差［2］。Triton对于细胞还有较强的毒性作用，因此在脱细胞后也要尽量清除组织支架上残留的Triton。在脱细胞过程中，Triton X－100常与其它洗涤剂搭配使用［6，52］，如与十二烷基 硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）搭配，往往可以起到很好的效果［2，26］。

3.2.3 离子洗涤剂 离子洗涤剂对溶解细胞质和核都很有效，但它也能通过破坏蛋白之间的键而使蛋白质变性。最常用的离子洗涤剂是十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、脱氧胆酸钠（Sodium deoxycholate，SD）和 Triton X－200［6，25－29］。

SDS对脱去组织中的细胞成分非常有效，能将残留的细胞核成分和蛋白清除得更彻底［25］。但SDS对ECM的破坏也更强，会使GAG密度下降，破坏胶原的完整结构。不过SDS不会清除组织中的胶原。由于SDS对核清除能力较强，常与清除细胞质能力较强的 Triton X－100合用［2，26］。

SD对清除残留的细胞成分也非常有效，但与SDS相比，它对组织本身结构的破坏更大。目前还没有单独使用SD进行组织脱细胞的报道，因此很难估计它单独对ECM的作用。SD也可以与其他两性离子洗涤剂一起对神经组织进行脱细胞，但效果并不如Triton X－200和两性离子洗涤剂一起作用好，后者对神经组织的脱细胞能取得较理想的效果［28，29］。

3.2.4 两性离子洗涤剂 两性离子洗涤剂表现出非离子和离子洗涤剂的双重特性。两性离子洗涤剂更容易使蛋白质变性。常用的有3－［（3－胆固醇氨丙基）二甲基氨基］－1－丙磺酸（3－［（3－cholamidopropyl）dimethylammonio］－1－propanesulfonate， CHAPS）（用于血管脱细胞）［30］、硫代甜菜碱－10（Sulfobetaine－10，SB－10）和－16（SB－16）（用于神经脱细胞）［28，29］。经CHAPS处理的动脉，具有组织学意义上的正常胶原，其弹力蛋白形态和胶原成分都与原动脉相似。虽然经CHAPS处理后的血管爆破压和最大应力都会有显著下降，不过这和使用Triton X－100与低／高渗溶液处理后的结果相似［30］。对于神经组织的脱细胞，外周神经已经成功用SB－10，SB－16和 Triton X－200进行了脱细胞，其效果比Triton X－100与SD结合处理的效果更好，对ECM的影响更少［28，29］。

3.2.5 磷酸三丁酯 磷酸三丁酯（Tri（n－butyl）phosphate，TBP）是一种有机溶剂，近几年开始用于脱细胞。用TBP可以完全清除鼠尾韧带中的细胞核成分，不过在韧带与骨的连接处细胞成分清除不是很完全。与对照组相比，TBP处理对从鼠尾分离的胶原纤维的抗张强度没有影响。但是对于ACL，TBP的处理会导致胶原成分减少［25，31］。TBP是一种很有前途的脱细胞试剂，它在脱细胞的过程中对ECM的机械性质影响最小［1］。

3.2.6 聚乙二醇 聚乙二醇（poly（ethylene glycol），PEG）是一种生物相容的两性聚合物（biocompatible amphiphilic polymer），可以用来诱导细胞融合，也能用于脱细胞处理。PEG能使分子间疏水部分的相互作用加强［36］，从而能破坏细胞膜上的蛋白、脂质等，引起细胞膜的改变。细胞膜的改变又引起细胞通透性和渗透压等一系列变化，最终细胞被破坏清除。但是，聚乙二醇单独无法完全清除细胞和细胞核，需要和其他试剂同时使用［44］。在脱细胞过程中，辅以物理方法（比如机械搅拌或用玻璃棒轻轻挤压组织［35］）可以获得更好的效果。与曲拉通等洗涤剂方法或胰蛋白酶方法相比，PEG为血管脱细胞的效果更好［35，53］，并且PEG不是洗涤剂，对细胞毒性更小，不需要进行大量冲洗，移植应用也更安全。

3.2.7 低渗和高渗溶液 低渗和高渗溶液可以通过渗透压的变化溶解组织中的细胞。例如，通过低渗溶液（10m M Trizma HCl，5m M EDTA）处理11小时后，再用高渗溶液（50m M Trizma HCl，1M NaCl，10m M EDTA）处理11小时，就能引起细胞的溶解［30］。之后再用化学或酶处理来帮助清除细胞碎片。

3.2.8 螯合剂 螯合剂，比如乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）和乙二醇双四乙酸（ethylene glycol bis（2－aminoethyl ether）tetraacetic acid，EGTA），可以形成一种印戒状的分子复合物，用于结合位于其中心的金属离子，并将其与细胞分离。一些二价阳离子（如Ca2＋和Mg2＋）对细胞的粘附非常必要，这些试剂通过结合在细胞与ECM粘附中出现的二价阳离子，来促使细胞与ECM分离。EDTA 往往和胰蛋白酶结合使用［53，39］。

3.2.9 交联剂 在脱细胞过程中，由于细胞丢失和ECM的破坏等，会使支架的机械特性改变。因此可以使用交联剂（如化学交联剂乙二醇缩水甘油醚EX－810［42］或天然的生物交联剂京尼平（Genipin）［43］等）交联支架，在抵抗脱细胞过程破坏的同时，也能起到促进脱细胞和封闭抗原的作用。也有实验直接使用交联剂EX－810配合蒸馏水和超声处理进行脱细胞，取得成功［42］，说明交联剂也能作为脱细胞的一种试剂使用。

3.3 酶学方法

脱细胞的酶处理技术包括蛋白酶消化、核酶消化和钙螯合物试剂的使用等。

3.3.1 胰蛋白酶 胰蛋白酶是脱细胞方案中最常用的蛋白水解酶之一。胰蛋白酶是一种高特异性的酶，能特异性打断精氨酸和赖氨酸C端的多肽键（如果它们连接的不是脯氨酸）。其最适温度为37摄氏度，最适p H为8.0。胰酶极易被血清中和，不必进行大量的冲洗，易于使用，生物相容性高。不过胰酶虽然常用，但它的脱细胞效果并不十分出色，特别对于较厚的组织，胰酶很难完全清除深部的细胞成分［39，40，53］。

有些研究表明，使用0.05%胰蛋白酶／0.02%EDTA和搅拌处理猪肺瓣膜24小时，其脱细胞作用很有效［32］；而另一些研究表明，使用0.5%胰蛋白酶，0.05%EDTA，0.02%庆大霉素，0.02 mg／ml脱氧核苷酸酶（DNase）和20μg／ml核苷酸酶A（RNase A），在超纯净水中以37摄氏度搅拌17小时能使细胞失活，但却无法从组织中清除细胞成分［24］。

胰蛋白酶对组织的影响也有副作用。胰酶对ECM会有不同程度的破坏，其程度随着时间的推移而增加，甚至会造成严重的影响［6，32，41］。不过胰酶不会影响组织中的胶原数量。延长组织在胰蛋白酶／EDTA中的时间会极大减少弹力蛋白和GAG含量，甚至会减少组织的抗张强度达50%［1］。因此要减少胰蛋白酶对ECM的影响，就要尽量减少胰蛋白酶的作用时间。

3.3.2 核酶 核酶分为内切酶和外切酶。内切酶催化核苷酸或脱氧核苷酸内部键的水解，而外切酶催化核苷酸或脱氧核苷酸末端的键水解，它们最终都导致DNA或RNA的降解。

3.3.3 磷酸酯酶A2 磷酸酯酶A2（Phospholipase A2，PLA2）是一种特异性的酯酶，用于水解细胞的磷脂成分，因此可以用来在脱细胞过程中溶解细胞。PLA2可以在sn－2处打断细胞膜上甘油磷脂的酯键，使其变为游离脂肪酸和溶血磷酸。PLA2催化水解需要Ca2＋，胰PLA2适应的p H 范围为7－9［33］。PLA2单独作用对细胞核的清除能力较弱，且长时间作用对GAG的破坏作用较大，因此可与其他洗涤剂如SD配合，能显著缩短脱细胞时间，提高脱细胞效果［34］。

3.4 蛋白酶抑制剂

在脱细胞过程中，很多蛋白酶会从被破坏的细胞中释放。在长时间的化学处理过程中，这些酶可以损伤ECM的超微结构。因此，有必要在浸润组织的溶液中加入蛋白酶抑制剂（使用胰蛋白酶等脱细胞除外）如苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF）、抑肽酶、亮肽素等。p H7－8的缓冲溶液能抑制许多蛋白酶，控制脱细胞的时间也能限制蛋白酶对组织的影响［1］。

3.5 抗生素

为了避免在脱细胞过程中造成微生物污染，应该向溶液中加入抗生素比如青霉素、链霉素等。但要注意清洗支架时将这些抗生素清洗干净，以免对宿主造成影响。

4 残留化学物质的清除

用化学或酶学方法脱细胞后，由于所使用的试剂对组织都有一定程度的损伤作用，并且可能在移植后对宿主造成影响，如对细胞的毒性作用或诱导宿主机体产生超敏反应等。因此有必要在脱细胞处理完成后清除残留在组织支架上的化学物质或酶。

5 组织多样性和不同脱细胞方案的影响

前文已经述及，同样的脱细胞方案对不同的组织效果不同，有可能在一种组织上很有效的脱细胞方法，在另一种组织中却完全没有效果［24，32］。而对于相同的试剂，不同的作用时间、顺序和方法，也可能造成不同的结果［32］。甚至可能在脱细胞方案中的微小差别也会影响实验结果。因此对于我们研究的每一种组织，都有必要完善我们的脱细胞方案来获得更好的结果。

由于脱细胞试剂或方法往往是针对细胞的某一个部位来破坏或清除细胞，因此单一的试剂或物理方法不能达到理想的脱细胞结果。我们需要根据脱细胞试剂或物理方法本身的特点，进行合理的搭配与互补，才能获得较好的脱细胞效果。比如Triton X－100（对细胞质清除较好）与SDS（对细胞核清除较好）相配合。又如涂秋芬等以超声处理与交联剂配合［42］，在脱细胞的同时尽量保证支架的完整性与三维结构，以利于移植后的细胞再生。

对于血管、瓣膜、软骨等软组织来说，使用Triton X－100配合SDS是比较成熟的办法。此方法已经被很多人所使用，在处理时间恰当的情况下，能有效去除细胞成分而不对ECM造成明显的影响。对于骨组织，由于其机械强度也是很重要的一个方面，所以需要重点注意脱细胞过程中对胶原纤维的破坏程度和对胶原纤维之间的连接及其三维结构的影响。在20世纪50年代Martz等就使用H2O2浸泡等方法制作出了被称为 Kiel骨的脱细胞骨［37，38］，并在随后的几十年中获得了广泛的临床应用［47］。在此基础上，使用H2O2——乙醚的方法制作脱细胞骨，在机械性能和免疫反应两方面都取得了较好的效果［49，50，51］。对于神经组织，虽然很多物理方法如冻融和放射等对神经细胞有较好的效果，但如前所述，其对神经纤维的破坏和对神经细胞的再生效果还存在争议［46，48］。有报道指出，使用 Triton X－200和 SB－10或SB－16能取得比Triton X－100和SD更好的脱细胞效果［28，29，46］。

6 总结

绝大多数脱细胞方案都需要多种方法或试剂相结合使用，根据组织的不同制定不同的方案，在尽量保存ECM完整性的情况下尽可能多地脱去组织中的细胞成分。一种可能的思路是通过不同脱细胞方法的优缺点互补来提高脱细胞的效率。在脱细胞时，要尽量缩短处理时间，通过循序渐进的方式，找到最合适的时间点，以期达到理想的脱细胞效果。目前看来，几乎所有的脱细胞方法都会对细胞支架产生影响，但影响的强弱和方面有所不同：有的会使ECM成分丢失，有的会改变ECM超微结构从而使其机械特性受到影响。我们应该根据实际需求选择脱细胞的方式，使其对我们需要用到的性能影响最小。需要注意的是，有些处理过程虽然不会对ECM造成直接的影响，但有可能影响支架在植入受体后的变化，比如更容易被体内的酶降解。

迄今为止，还没有能100%去除组织内细胞成分的方法。但从现在的应用来看，目前的脱细胞水平已经能满足移植所需要的安全性。已经有多种脱细胞组织进入了临床，比如人类真皮（Alloderm®，Life－Cell，Corp.），猪小肠结膜（SurgiSIS®，Cook Biotech，Inc.；Restore®，DePuy Orthopaedics，Inc.），猪膀胱 （ACell，Inc.），猪心脏瓣膜 （Synergraft®，Cryo Life，Inc.）［1］。这也表示组织脱细胞技术具有重要的意义和广阔的前景。

［1］Gilbert TW，Sellaro TL，Badylak SF.Decellularization of tissues and organs［J］.Biomaterials 2006；27：3675－3683.

［2］Shupe T，Williams M，Brown A，et al.Method for the decellularization of intact rat liver［J］.Organogenesis 2010；6（2）：134－136.

［3］Hashimoto Y，Funamoto S，Sasaki S，et al.Preparation and characterization of decellularized cornea using high－hydrostatic pressurization for corneal tissue engineering［J］.Biomaterials 2010；31：3941－3948.

［4］Funamoto S，Nam K，Kimura T，et al.The use of high－hydrostatic pressure treatment to decellularize blood vessels［J］.Biomaterials 2010；31：3590－3595.

［5］Yin M，Liu JF，Fujisato T，et al.Tissue－engineered vascular scaffolds prepared by ultrahigh pressure decellularization treatment［J］.Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research 2008；12（10）：1969－1972.

［6］Wang P，Li C，Zhang RQ，et al.Various method of preparing acellular tissue－engineered xenogeneic valve stents［J］.Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research 2009；13（16）：3041－3044.

［7］Montoya CV，MacFetridge PS.Preparation of EX Vivo－Based Biomaterials using Convective Flow Decellularization［J］.Tissue Engineering 2009；15（2）：191－200.

［8］Baiguera S，Jungebluth P，Burns A，et al.Tissue engineered human tracheas for in vivo implantation ［J］.Biomaterials 2010；31：8931－8938.

［9］Ngangan AV，Mc Devitt TC.Acellularization of embryoid bodies via physical disruption methods［J］.Biomaterials 2009；30：1143－1149.

［10］Roberts TS，Drez Jr D，McCarthy W，et al.Anterior cruciate ligament reconstruction using freeze－dried，ethylene oxide－sterilized，bone－patellar tendon－bone allografts［J］.Am J Sports Med 1991；19：35－41.

［11］Gulati AK.Evaluation of acellular and cellular nerve grafts in repair of rat peripheral nerve［J］.J Neurosurg 1988；68：117－123.

［12］Sasaki S，Funamoto S，Hashimoto Y，et al.In vivo evaluation of a novel scaffold for artificial corneas prepared by using ultrahigh hydrostatic pressure to decellularize porcine corneas［J］.Molecular Vision 2009；15：2022－2028.

［13］Kingsley DH，Hoover DG，Papafragkou E，et al.Inactivation of hepatitis A virus and a calicivirus by high hydrostatic pressure［J］.J Food Protect 2002；65：1605－1609.

［14］Ichimori H，Hata T，Matsuki H，et al.Barotropic phase transitions and pressure－induced interdigitation on bilayer membranes of phospholipids with varying acyl chain lengths［J］.Biochim Biophys Acta 1998；1414：165－174.

［15］Moerman F.High hydrostatic pressure inactivation of vegetative microorganisms，aerobic and anaerobic spores in pork Marengo，a low acidic particulate food product［J］.Meat Sci 2005；69：225－232.

［16］Ota T，Taketani S，Iwai S，et al.Novel Method of Decellularization of Porcine Valves Using Polyethylene Glycol and Gamma Irradiation［J］.The Annals of Thoracic Surgery 2007；83：1501－1507.

［17］Falke G，Yoo JJ，Kwon TG，et al.Formation of corporal tissue architecture in vivo using human cavernosal muscle and endothelial cells seeded on collagen matrices ［J］.Tissue Eng 2003；9：871－879.

［18］Freytes DO，Badylak SF，Webster TJ，et al.Biaxial strength of multilaminated extracellular matrix scaffolds［J］.Biomaterials 2004；25：2353－2561.

［19］Hodde JP，Badylak SF，Brightman AO，et al.Glycosaminoglycan content of small intestinal submucosa：a bioscaffold for tissue replacement［J］.Tissue Eng 1996；2：209－217.

［20］Brown B，Lindberg K，Reing J，et al.The bacement membrane component of biologic scaffolds derived from extracellular matrix［J］.Tissue Eng 2006；12（3）：519－526.

［21］Hodde JP，Record RD，Liang HA，et al.Vascular endothelial growth factor in porcine－derived extracellular matrix［J］.Endothelium 2001；8：11－24.

［22］Voytik－Harbin SL，Brightman AO，Kraine MR，et al.Identification of extractable growth factors from small intestinal submucosa［J］.J Cell Biochem 1997；67：478－491.

［23］Seddon AM，Curnow P，Booth PJ.Membrane proteins，lipids and detergents：not just a soap opera［J］.Biochim Biophys Acta 2004；1666：105－117.

［24］Grauss RW，Hazekamp MG，Oppenhuizen F，et al.Histological evaluation of decellularized porcine aortic valves：matrix changes due to different decellularization methods［J］.Eur J Cardiothorac Surg 2005；27：566－571.

［25］Woods T，Gratzer PF.Effectiveness of three extraction techniques in the development of a decellularized bone－anterior cru－ciate ligament－bone graft［J］.Biomaterials 2005；26：7339－7349.

［26］Elder BD，Eleswarapu SV，Athanasiou KA.Extraction techniques for the decellularization of tissue engineered articular cartilage constructs［J］.Biomaterials 2009；30：3749－3756.

［27］Wu Z，Zhou Y，Li N，et al.The use of phospholipase A（2）to prepare acelluar porcine cornal stroma as a tissue engineering scaffold［J］.Biomaterials 2009；30：3513－3522.

［28］Hudson TW，Liu SY，Schmidt CE.Engineering an improved acellular nerve graft via optimized chemical processing ［J］.Tissue Eng 2004；10：1346－1358.

［29］Hudson TW，Zawko S，Deister C，et al.Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration［J］.Tissue Eng 2004；10：1641－1651.

［30］Dahl SL，Koh J，Prabhakar V，et al.Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation ［J］.Cell Transplant 2003；12：659－666.

［31］Cartmell JS，Dunn MG.Effect of chemical treatments on tendon cellularity and mechanical properties［J］.J Biomed Mater Res 2000；49：134－140.

［32］Schenke－Layland K，Vasilevski O，Opitz F，et al.Impact of decellularization of xenogeneic tissue on extracellular matrix integrity for tissue engineering of heart valves［J］.J Struct Biol 2003；143：201－208.

［33］Kudo I，Murakami M.Phospholipase A2 enzymes［J］.Prostaglandins Other Lipid Mediat 2002；68－69：3－58.

［34］Wu Z，Zhou Y，Li NY，et al.The use of phospholipase A2 to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold［J］.Biomaterials 2009；30：3513－3522.

［35］Uchimura E，Sawa Y，Taketani S，et al.Novel method of preparing acellular cardiovascular grafts by decellularization with poly（ethylene glycol）［J］.J Biomed Mater Res A 2003；67（3）：834－837.

［36］Arakawa T，Serge N.Timasheff.Mechanism of Poly（ethylene glycol）Interaction with Proteins［J］.Biochemistry 1985；24：6756－6762.

［37］Martz R.A new method of bone maceration［J］.J Bone Jt Surg 1957；39A：153－166.

［38］Martz R，Lenz W，Graf R.Spongiosa test of bone grafts for transplantation［J］.J Bone Jt Surg 1954；36A：721－731.

［39］陆军，肖学钧，陈欣欣.比较牛颈静脉去细胞处理试验方法［J］.岭南心血管病杂志2008；14（6）：440－443.

［40］崔晓平，张永红，薛军.胰蛋白酶法和Triton X－100法脱猪软骨细胞的比较 ［J］.中国组织工程研究与临床康复2009；13（46）：9080－9083.

［41］杨立信，徐志云，黄盛东，等.三种去细胞方法构建的主动脉瓣膜支架的性能比较 ［J］.第二军医大学学报2007；28（1）：8－12.

［42］涂秋芬，张怡，李艳，等.一种新型的脱细胞组织工程血管支架［J］.生物医学工程学杂志2007；24（2）：379－384.

［43］陈平，李新华，邢万红.京尼平交联的脱细胞牛心包生物支架材料的实验研究 ［J］.中国医药导报2010；7（6）：28－30.

［44］陶凯，李新华.不同脱细胞方法对猪主动脉的组织学及生物力学特性的影响 ［J］.中国现代医生2009；47（4）：37－38.

［45］胡刚，刑彬，欧来良，等.动物血管脱细胞方法及细胞外基质材料评价研究 ［J］.中国生物医学工程学报2008；27（6）：912－921.

［46］姜炜鹏.脱细胞神经基质的制备方法的研究进展 ［J］.四川解剖学杂志2009；17（4）：25－27.

［47］何创龙，王远亮，杨立华，等.Kiel骨理化性能的实验分析 ［J］.重庆大学学报2004；27（7）：40－44.

［48］王雷，蒋电明.脱细胞异体神经移植在周围神经缺损修复中的应用研究进展 ［J］.中国修复重建外科杂志2007；21（6）：611－613.

［49］胡永康，安洪，曹本珍，等.四种脱蛋白骨组织学和生物力学比较研究 ［J］.中华创伤杂志1998；14（5）：277－279.

［50］曹凯，舒勇，韩智敏，等.过氧化氢－乙醚法制备脱蛋白骨的理化性质研究 ［J］.江西医学院学报2008；48（1）：5－8.

［51］张旗涛，于有，杨林，等.人脱细胞骨复合骨髓基质细胞成骨活性的实验研究 ［J］.中国骨质疏松杂志2004；10（1）：35－38.

［52］崔永言，朱辉，李慧，等.一种新的脱细胞阴茎海绵体基质的制备方法 ［J］.中国微创外科杂志2008；8（12）：1137－1139.

［52］韩啸，蒋雄刚，徐鹏，等.聚乙二醇和胰蛋白酶用于猪动脉管道去细胞效果比较 ［J］.华中科技大学学报（医学版）2007；36（4）：551－553.