大肠杆菌卷曲菌毛及其致病性

邢艳苹,王 瑜,杨 峰,雷连成

(吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062)

以往认为埃希菌属、沙门菌属等肠杆科细菌表面的菌毛功能主要与细菌黏附及侵袭力有关,其本身的组成成份与其致病性无直接关系。近 10余年的研究发现,埃希菌属卷曲菌毛的成分与临床上的脓毒症(sepsis)、败血症(septicemia)、感染性休克(septic shock)、全身炎症反应综合征(Systemic In flammatory Response Syndrome,SIRS)等一系列由革兰阴性杆菌引起的严重感染性病症的发生、发展及转归有关。

1 大肠杆菌卷曲菌毛及其编码基因

大肠杆菌卷曲菌毛(curli)是存在于大肠杆菌表面的一种异聚蛋白丝状附属物,直径 4～7 nm,长度不等[1],富含保守的 β-折叠,每个 β-折叠按平行于卷曲菌毛轴线的方向相互叠加,而 β-折叠自身垂直于菌毛轴线[2]。卷曲菌毛结构高度稳定,理化抵抗力较强,能抵抗蛋白酶消化和去污剂降解;在 10 g/L的 SDS溶液中煮沸不溶解,在体积分数为 0.90的甲酸中才能解聚[3～5]。

大肠杆菌卷曲菌毛由操纵子基因 csg(curli subunit genes)编码和转录。csg包括csgBA(C)和 csgDEFG等 2个操纵子[6～9]。前者由 csgB,csgA构成,后者由 csgD,csgE,csgF和 csgG构成。csgC目前尚不清楚是否存在,为假定基因(putative gene)[8],因为既没有发现csgC的转录产物,也没有csgC在卷曲菌毛生物合成中具体作用的相关报道。在后续研究中,统一使用csgBA表示 csgBA(C)。2个操纵子向相反方向转录,其中 csgB和 csgD之间还有 521碱基对的间隔序列[10]。除csgD外,其他基因前都有一段编码跨内膜转位信号肽的序列[11]。2个操纵子在大肠杆菌株系间非常保守。

Dyer等通过 PCR检测,发现所有被测的大肠杆菌无论能否表达卷曲菌毛,都可以检测到 csgA和 csgD[12]。许多具有卷曲菌毛编码基因的大肠杆菌并不表达和产生卷曲菌毛,其卷曲菌毛表达与否受到复杂因素的影响[13]。

2 大肠杆菌卷曲菌毛的致病作用

2.1 卷曲菌毛的黏附能力

卷曲菌毛的黏附性很强,能结合许多生物体表面物质,包括纤黏蛋白、层黏连蛋白、纤溶酶原、接触时相蛋白、Ⅰ型主要组织相容性复合体等[14]。体内外试验表明,产生卷曲菌毛的细菌致病力比不产生卷曲菌毛的细菌更强,包括黏附、定植和侵袭宿主细胞的能力。

大肠杆菌可以在哺乳动物宿主体内产生卷曲菌毛[15]。卷曲菌毛增强禽大肠杆菌的定植和存活能力,相同菌株的卷曲菌毛表达如果受到抑制,其存活能力下降[16]。Gophna等证明,与不能产生卷曲菌毛的大肠杆菌O 157∶H 7相比,能产生卷曲菌毛的大肠杆菌侵袭 HEp-2细胞的能力更强[17]。Uhlich等通过给小鼠灌服大肠杆菌O 157∶H 7(ATCC43895)发现,与不产生卷曲菌毛的变异株相比,产生卷曲菌毛的变异株致死小鼠的时间更短[18]。

2.2 卷曲菌毛与淀粉样蛋白

生物化学、生物物理学和图像分析研究表明,大肠杆菌卷曲菌毛是淀粉样蛋白(amyloid)[19]。近年来,淀粉样蛋白被认为是一些疾病发生的标志,如阿尔茨海默症、帕金森症、Ⅱ型糖尿病、全身性淀粉样变性和朊蛋白相关疾病[20]。

某些株系的大肠杆菌可产生淀粉样蛋白,极类似于阿尔茨海默症在脑中堆积形成的沉淀斑 。Virchow于 1854年首次用淀粉样蛋白描述在给病变脑组织染色时观察到的这种沉淀,这种沉淀能和碘强烈结合[22]。淀粉样蛋白还可以结合刚果红染料、硫代黄素 T抵抗蛋白酶消化和去污剂降解[23]。

是否因为细菌感染使这些淀粉样蛋白形成于脑部便出现了阿尔茨海默症?如果是细菌感染促使可溶性蛋白转变为淀粉样蛋白,可以推测以下 2种原因:①直接通过细菌产生的淀粉样蛋白致病;②间接促使体细胞生成的淀粉样蛋白前体形成沉淀。因此,可以将大肠杆菌作为一个很好的研究淀粉样蛋白沉积斑形成的模型系统,深入研究可溶性蛋白转变成淀粉样蛋白的分子机制,进而预防和治疗淀粉样蛋白相关疾病[24]。

2.3 卷曲菌毛与生物膜

Kanamaru等发现,从前列腺炎病人尿道分离的大肠杆菌,其卷曲菌毛的表达和生物膜(biofilm)形成密切相关[25]。生物膜是一种附着于有生命或无生命物质表面的被菌外基质包裹的有组织的细菌群体[26]。卷曲菌毛促进大肠杆菌在无生命物质表面,如玻璃、特富龙(Telflon)、聚丙烯、聚氯乙烯等物质表面形成生物膜[27]。卷曲菌毛相互缠结,把邻近的细菌联结成小群落,逐渐发育为生物膜。

生物膜结构复杂,外形似“基座”状,内部有通水的孔道。大肠杆菌成熟生物膜中包含细菌表面蛋白、卷曲菌毛、菌外基质。菌外基质是一种复杂的含水环境,包含蛋白质、多糖、DNA、RNA和离子等。其中多糖的成分差异很大,主要是纤维素,还有 β-1,6-N-乙酰-D-葡糖胺聚合体、乔拉尼奇酸(colanic acid)、藻酸盐等成分[28]。

与游离状态的细菌相比,生物膜中的细菌的生理机能和新陈代谢水平不同程度降低,以抵御外界不良环境因素带来的各种影响[29]。大肠杆菌形成生物膜后,对消毒剂、杀菌剂的抵抗力增强;同时,生物膜中的细菌对抗生素的敏感性也降低,使疗程延长[30]。

2.4 卷曲菌毛蛋白与脓毒症

临床上,细菌感染引起的感染性休克、败血症、脓毒症(sepsis)及全身炎症反应综合征(sins)是导致危重病人死亡的主要原因之一 ,这其中又以革兰阴性菌特别是肠杆菌科细菌中的大肠杆菌所占比例为大。以往认为,革兰阴性菌引起败血症、脓毒症、感染性休克的物质主要是细菌的菌体成分如脂多糖/内毒素(1ipopolyrsacc hande,LPS/endotoxi),而菌毛的作用主要表现在对宿主细胞的黏附方面。但近年来的研究结果表明,肠杆菌科细菌表面的curli菌毛的成份cs和CsgB也与败血症、脓毒症、感染性休克的发病及病情转归有很大关系。已有报道用大肠杆菌 MC 4100株(野生型表达curli菌毛的大肠杆菌)、MHR 261株(cs变株,可分泌 Cs蛋白,但不形成 curli菌毛)、MHR 204株(csgA突变株,不表达 Cs蛋白)及 MHR 222株(csgA及 csgS双突变株、CsgA及CsgB蛋白均不表达)做体外和体内实验,能表达Cs亚单位蛋白的MC4100株组和 MHR 261株组较其余两株组诱发炎症相关细胞因子(如TNF-Ot,IL-6,IL-1等)的水平显著要高,而且也能激活一氧化氮(nitric oxide,NO),2型一氧化氮激酶(typenitric oxde snthase,NO S2)系统引起血管平滑肌释放 NO;导致血管平滑肌舒张、血压下降、心动过速和体温降低等症状。这些实验结果均提示curli菌毛的 Cs与 CsgB蛋白在此类感染性疾病的转归中与 LPS共同起着重要作用。

3 卷曲菌毛致病的相关因素

3.1 相关配体

作为细菌菌毛的一种,curb菌毛也在细菌的黏附过程中发挥着重要的作用。curli菌毛上的相关配体与相对应的分子结合,介导细菌黏附并进入真核细胞内。curli上存在着层黏连蛋白、纤溶酶原、组织型纤维蛋白溶酶原、MHC I类分子、血纤维蛋白原的对应配体,能通过与纤维结合素作用介导细菌粘附、侵入真核细胞的过程[30]。

3.2 NO和NOS2

在脓毒症、感染性休克的病人血清中,正常量的NO对于机体抵抗感染性病菌入侵是必要的,但NO水平的过度升高能导致患者血管平滑肌舒张,从而引起患者出现血压降低、心动过速和体温降低等症状,NO通过 NOS2引起的低血压是感染性休克病人致死的一个主要原因。最近的实验结果表明,不管在动物实验或体外血管平滑肌培养实验中,用不同菌株分别感染实验小鼠或组织培养液内后,能表达 CsgA和 Cs蛋白菌株组的小鼠血清内和血管平滑肌体外培养液内 NO水平较 csgA或cs或csgB基因缺失菌株组的小鼠血清和血管平滑肌体外培养液内的NO水平明显为高。而实验中所用菌量所含 LPS(以往认为引 N水平升高的主要物质)的量远不能刺激机体或组织细胞产生如此高浓度的N 0[31]。

3.3 炎症相关因子

在脓毒症、感染性休克、SIRS所致损害里,真正由革兰阴性菌菌体物质直接导致的损伤是很小的。病人机体的损害主要是由细菌进入机体后引起机体自身产生的高水平炎症相关分子,故临床上病人血清中TNF-ot及 IL-6水平的升高常被作为脓毒症、感染性休克、SIRS发生中细胞因子级联反应的启动及其严重程度的标志。相关的实验结果显示,用大肠杆菌 MC 4 100株、MHR 261株、MHR 204株以及 MHR 222株分别感染刺激人巨噬细胞 5～6 h后,能表达 CsgA蛋白的MC 4 100株和 MHR 261株组诱导巨噬细胞产生 NF-ot,IL-6和 II-8的量显著高于不能表达 CsgA蛋白的 MHR 222株和MHR 204株组,表明 CsgA蛋白在刺激炎症相关细胞因子分泌中起着重要的作用。

4 结论与展望

随着研究的不断深入,对于大肠杆菌卷曲菌毛的认识也在不断加深。在体内,大肠杆菌卷曲菌毛侵入真核细胞可以躲避宿主的免疫监测,并可以作为储存器导致再次感染。产生卷曲菌毛的大肠杆菌的急性感染可以导致脓毒血症,慢性感染可以导致与淀粉样蛋白相关的疾病。大肠杆菌卷曲菌毛的结构高度稳定,一旦卷曲菌毛在体内积累形成淀粉样蛋白,病程将很难逆转,目前尚无治疗方法。因此,对于卷曲菌毛引发的炎症反应的疾病应及早发现、及早治疗,以预防或阻断疾病的发生与发展。在体外,产生卷曲菌毛的大肠杆菌可以形成生物膜。生物膜内的大肠杆菌通过降低新陈代谢水平,增强对外界不良环境因素的适应性,尤其表现在抗生素抗性方面。

5 存在的问题

综上所述,产生卷曲菌毛的大肠杆菌的致病性比不产生卷曲菌毛的菌株显著增强。对于卷曲菌毛的研究具有重要的现实意义。大肠杆菌卷曲菌毛的分子生物学特性,大肠杆菌卷曲菌毛在体内的致病机制,大肠杆菌卷曲菌毛所致疾病的早期诊断和防控办法,在体外参与形成生物膜的过程中大肠杆菌卷曲菌毛的具体作用,大肠杆菌是否能通过卷曲菌毛的作用在体内形成生物膜,都是值得进一步研究的问题。

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(责任编辑:石瑞珍)