布鲁菌病的研究进展

刘晓贺,韩文瑜

(吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062)

布鲁菌病(Brucellosis)是由布鲁菌(Brucella)引起的主要侵害生殖系统的一种全世界广泛分布的人畜共患慢性细菌传染病。该病属自然疫源性传染病,在全世界各地都有很广泛的分布[1]。世界动物卫生组织(OIE)将其列为多种动物共患病,中国将其列为二类动物疫病。世界范围内每年出现约 50万例人间布鲁菌病病例,因此加强布鲁菌病的研究和综合防控具有重要意义[2]。

1 布鲁菌病的概况

1.1 病原学特征

布鲁菌有 6个种(Species),20个生物型(Biotype),包括羊布鲁菌氏(melitensis)3个生物型;牛布鲁菌(Brucella abortus)9个生物型;猪布鲁菌(Brucella suis)5个生物型;沙林鼠布鲁菌氏(Brucellaneotomae)1个生物型;绵羊附睾布鲁菌(Brucellaovis)和犬布鲁菌(Brucella Caris)各有 1个生物型[3]。布鲁菌不产生外毒素,但有毒性较强的内毒素,其中以羊布鲁菌内毒素毒力最强,因此内毒素是布鲁菌的主要致病因素。不同种的布鲁菌其致病力也不同。一般认为羊布鲁菌的致病力最强,猪布鲁菌毒力次之,牛布鲁菌毒力最弱。

1.2 流行病学特点

在自然条件下,布鲁菌病主要在人和家畜(主要是羊、牛、猪)中广泛分布,某些鸟类、昆虫、爬虫类、两栖类和鱼类等动物也可携带布鲁菌。其中绵羊和山羊往往是布鲁菌病流行的主要传染源。

家畜和野生动物都可通过采食污染奶或接触污染新生儿组织或液体而感染。这些动物又可作为动物源性食品添加而再次引发该病。为此全世界很多农业组织很关注该病[4]。发达国家通过疫苗接种、监督和检疫等措施有效控制了食用动物中布病的传播。感染人通常是由于接触感染动物或饮用未消毒的奶制品,没有关于人与人之间直接传播的报道。然而,人可因吸入被污染的尘埃或气溶胶而感染。所以布鲁菌是全世界很多实验室共同的获得性感染的病原菌。

2 布鲁菌病的诊断方法

诊断技术一直是布病研究的重要领域[5]。在 20世纪末的 80～90年代,由于分子生物学的飞速发展,有力地推动了包括布病在内的疫病诊断技术发展。

2.1 病原学诊断

布鲁菌的病原学诊断除通过病料直接涂片染色镜检外,已有用过氧化物酶标记或荧光标记的特异性免疫染色检验技术[6]。DNA探针和PCR技术已经成为病原诊断的实用方法,有一种叫做野外脉冲凝胶电泳的技术用于布病原鉴定,这种技术可以鉴别布鲁菌各个种。

准确的诊断对布病防控有着及其重要的作用,当今PCR诊断技术主要有 3类:(1)用于群体试验鉴定感染群;(2)确认感染群中的感染动物及其病原的种,以便采取合适的防控措施;(3)确定流行病学状态以帮助流行病专家追踪传染源。

唐浏英等[7]开始将 PCR技术应用于布鲁菌的检测,针对牛布鲁菌氏杆菌 36 ku OMP基因设计引物,扩增 180 bp产物是 6个种间的同源性很高的保守序列,检测结果证明具有良好的特异性和敏感性。李兰玉等针对牛布鲁氏杆菌 31 ku OMP基因设计引物,试验结果表明其特异性和敏感性也较好。王胜昌等[8]利用编码 31 ku布鲁氏杆菌蛋白(BCSP31)的基因设计两对特异性的引物,对布鲁氏杆菌 R型、S型抗原,及其他不同病原菌分别进行内、外引物 PCR反应及套式 PCR反应,试验证明此 PCR方法具有特异性强,敏感性高的特点,尚未进行实际应用评测。有学者认为 PCR技术还不稳定,尚不能作为确诊依据,应结合其他检查判定结果。

2.2 血清学诊断

2.2.1 传统试验 传统方法的凝集试验(包括试管凝集试验、平板凝集试验)在发达国家已基本上停止使用,取代的方法是缓冲布鲁菌抗原试验,包括卡片试验、虎红平板凝集试验、缓冲平板凝集试验。在国际贸易中,缓冲布鲁菌抗原试验是牛、羊、猪种布病诊断的指定试验,作为筛选试验用。

补体结合试验至今仍是布病的重要诊断方法,是牛、羊及绵羊副睾种布病诊断的国际贸易指定试验,作为确诊试验用。乳环试(MRT)依然是奶牛布病监测的主要方法。

2.2.2 ELISA 酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种与 CFT效果相当的试验,操作更方便,既可以作为确定试验,又可以作为筛选试验。但只有用于牛种布病的 ELISA是国际贸易指定试验。这种 ELISA方法不但用于血清学诊断,还可用于乳汁检查。其它种布病上的应用还需进一步改进抗原和积累数据。

关于 ELISA的研究报道相当多:谷登峰等[9]建立了一种 Do t-EL ISA和单克隆抗体相结合的检测方法,该试验证明该方法具有特异、敏感、经济实用的优点。鲁齐发等[10]在制备布鲁菌抗原辣根过氧化物酶结合物基础上,建立了双抗原夹心法酶免疫试验DA gS-ELISA及 DA gS-DIEA,并与间接ELISA、试管凝集试验及虎红平板凝集试验对部分布鲁菌病患者、可疑患者、布鲁菌感染羊只以及布鲁菌感染的实验动物血清标本进行了检测比较。结果表明,阳性率以 DA gSELISA最高(60.0%～62.9%)。张俊琴等[11]对此方法的实用效果进行了进一步的评价,表明 DA gS-ELISA对亚急性、慢性病人的灵敏度、符合率、卡帕值均较高,并且用聚乙烯材料做包被板比聚苯乙烯要更经济且诊断价值更高,ELISA的效果关键在于抗原的选用。在已经标准化了的牛仔布病ELISA诊断中使用了 S-LPS抗原。另外,从牛种布鲁菌和羊种布鲁菌获得的能表达高度免疫原性蛋白的基因,可生产用于鉴别 S19和Rev.1疫苗免疫与自然感染的蛋白。

3 布病分子生物学

Galdiero E等[12]完成羊布鲁菌 M16株全基因组测序工作,基因注释尚未完成。目前主要研究的保护性抗原为外膜蛋白(Omp)、核蛋白 L7/L12、胞质结合蛋白 P39等。Omp 25和 Omp31是研究最多的两种布鲁菌外膜蛋白。此外,还有Omp 36蛋白是一类构成跨膜通道的膜孔蛋白,在羊种布鲁菌中含量较少,具有良好的免疫原性。核蛋白 L7/L12由Rp1L基因表达,在布鲁菌各菌株间具有高度的保守性,是重要的优势抗原。以核蛋白L7/L12为基础构建的疫苗对感染具有显著的抵抗作用。最近研究结果表明[13],牛布鲁菌的翻译延伸因子3(IF3)具有很强的免疫保护作用,其大肠杆菌表达的 IF3重组蛋白可体外刺激淋巴细胞增殖,该蛋白是很有前景的布鲁菌亚单位苗的候选抗原。布鲁菌的特征之一是不表达与其他病原微生物相似的经典的毒力因子。迄今为止,对布鲁菌在吞噬细胞内的生存与繁殖机制,以及它与宿主的相互作用关系所知甚少。布鲁菌在细胞内生存的分子特征也是布病防控研究的关键。布病分子生物学研究工作的一个重要方面就是研究宿主响应布鲁菌感染差异表达的功能基因。

目前研究布鲁菌感染宿主细胞基因表达谱的变化,主要是利用基因芯片技术进行检测发生表达变化的基因,这无疑是人为界定了检测基因的种类,缩小了获得有意义的相关基因的范围。而且以反刍动物的基因芯片作为筛检工具,在基因同源性上也可能影响差异表达基因的筛选。从宿主反应入手,研究布鲁菌感染宿主差异表达基因谱,是进一步研究布鲁菌致病分子机制的好方法。而且这些差异表达基因的发现,为布病的预防、治疗、检疫提供了更有价值的靶标分子。

4 布鲁菌病疫苗

目前研究认为,在绝大多数情况下,使用疫苗是控制牛、羊布病的有效方法。由于布鲁菌主要为胞内寄生,抗生素对其效果甚微,机体的细胞免疫对抑制该病起了至关重要的作用。因此对布病疫苗的研究主要集中在筛选弱毒株,构建突变株以及寻找亚单位疫苗等方面。

目前世界范围内广泛应用的布病疫苗有 2种,S19和Rev.1。在布鲁菌中未发现自然质粒,但可以通过基因注射、电穿孔转移技术将泛宿主基因转入布鲁菌内。目前对布鲁菌的疫苗研究主要是利用基因工程技术,对布鲁菌的部分基因进行各种修饰,以期在现有疫苗的基础上筛选出具有更强免疫保护力、且毒力稳定的弱毒株。

另外,人们也试图研究布鲁菌的DNA疫苗。由于机体的细胞免疫是控制布鲁菌感染的关键,因此作为研究布鲁菌DNA疫苗的候选分子主要集中在刺激 T细胞引起的细胞免疫的几个分子。目前对布鲁菌的毒力因子和胞内生存进行了大量研究,但对阐明布鲁菌致病机制还不够。随着B.melitensis[14],B.suis[15]和 B.abortus[16]全基因组完成测序,使一些新的方法应用成为可能。如采用比较基因组技术比较不同布鲁菌菌株基因组水平差异;蛋白质组技术比较强毒株与疫苗株间蛋白质表达的差异。这些研究促进了毒力因子寻找和致病机制的阐述以及疫苗、快速检测方法和新的抗微生物药物的研制。

5 布鲁菌病的防控

中国实施的布病综合性防控措施主要有[17]:动物检疫、病健分群、病畜扑杀、健康动物计划免疫。布病的防控主要采用畜用弱毒布病疫苗的预防接种。但免疫接种后,利用法定布病检测方法,畜群内接种家畜与自然感染家畜布病检测均呈阳性,无法进行有效区分。接种家畜对布鲁菌产生一定的抗体,属健康动物。而自然感染家畜属布病疫源动物,必须进行扑杀。而目前布病检测阳性动物难以扑杀是布病发病率上升的主要原因之一。由于现阶段中国扑杀政策难以完全实施,国内外又没有针对所有的布病免疫疫苗、区分健康接种动物与疫源感染动物的行之有效的方法,这样就造成传染源长期存在,疫病持续传播。因此准确诊断布病感染动物,正确区分健康接种动物和自然感染动物,研究布病致病的分子机制,对控制布病的暴发与流行、特别是传染源的控制尤其重要。

目前全国范围内布病流行呈上升趋势,而布病疫苗保护力并不十分理想,因此,除了研究有效的布病疫苗和诊断方法以外,研究布病致病的分子机制也十分重要。特别是利用基因芯片或构建 cDNA文库的方法,从宿主对野毒株或弱毒株感染产生不同的分子应答机制入手,寻求一个合适的生物标示分子,来区分野毒感染或人工接种,对布病的预防、治疗和检疫具有重要的科学指导意义。

6 结 论

布病流行范围广,持续时间长,不但严重威胁人类健康和畜牧业生产,同时也造成了巨大的经济损失。长期以来,布鲁菌病一直受到人们的关注和重视,在美国,布鲁菌还是潜在的生物战剂,始终受到军事医学家的高度重视;而且布鲁菌病在世界范围内,特别是在发展中国家仍无法被根除,目前只有英国和澳大利亚通过严格的卫生防疫措施消灭了布鲁菌病。另外,据WHO专家报告,由于生态环境变化,抗生素药物滥用及病原变异等原因,布氏菌致病性日趋严重,像布氏菌病一样的传染病仍是21世纪初全球面临的最大的健康问题。因此,需要在全国范围内增加对布鲁菌的重视程度,提高防范意识,加大防范力度,研制安全有效的疫苗、快速准确的检测方法和新的抗微生物药物,这对国家安全、人类健康和畜牧业发展都具有重要的现实意义。

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(责任编辑:石瑞珍)