奶牛乳房炎疫苗防治的研究进展

高 宇,冯 新,李林溪,赵红蕾,刁昱文,刘珊珊,顾敬敏,韩文瑜,雷连成

(吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062)

奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)又名奶牛乳腺炎,是奶牛乳腺常见发生的一种炎症,由多种因素引起,在奶牛群中的发病率有上升的趋势,严重影响奶牛业的发展,至今尚未有彻底解决的办法。在我国每年用于治疗奶牛乳房炎的费用近亿元人民币,由此可见,乳房炎对奶牛业的危害是巨大的。奶牛乳房炎发生原因众多,包括金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、支原体、霉形体还有病毒等等。病原体感染和环境等其他因素的影响都不可忽视。控制乳房炎的发生,其关键问题就是做好预防和治疗,还要定期对牛群进行乳房炎的排查,以消除其潜在的隐患。因此,疫苗的开发在防治奶牛乳房炎方面显得尤为重要。

实践证明,利用疫苗控制奶牛乳房炎发生是可行的。首先,奶牛乳房炎是因乳腺组织感染病原微生物所致,且以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌为主,占整个乳腺炎病例的 90%以上。其次,利用疫苗控制乳房炎具有无乳汁残留、降低乳腺感染的严重程度、控制隐性乳房炎的发生、操作简便、费用低廉等优点。本研究主要从金黄色葡萄球菌苗、大肠杆菌苗、链球菌苗和多联苗几方面阐述疫苗防治在奶牛乳房炎研究中的应用,为奶牛乳房炎的临床治疗提供理论依据。

1 金黄色葡萄球菌苗

金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)是引起奶牛乳房炎的主要病原菌,金黄色葡萄球菌可产生多种毒素和酶,故致病性强[1]。

Karakawa和Vann首次报道了金黄色葡萄球菌荚膜有 8个血清型,Sompolinsky等[2]将其扩展为 11个。据报道从美国和欧洲乳房炎乳汁分离的金黄色葡萄球菌中 100%和 98%金黄色葡萄球菌的血清型为 5型、8型和 336型,并且 94%～100%有荚膜多糖,荚膜多糖具有抗吞噬活性且阻止中性粒细胞识别抗金黄色葡萄球菌细胞壁成分的抗体[3]。

1.1 现有的金黄色葡萄球菌苗

目前,研制的金黄色葡萄球菌菌苗或类毒素已用于金黄色葡萄球菌性乳房炎的防治中,试验结果表明,不论是灭活苗,还是活苗,都能提高奶牛自发性治愈率,降低临床型乳房炎的发生率,且活苗免疫后的血清抗体效价明显高于灭活苗。

Pankey等[4]利用多种噬菌体型的金黄色葡萄球菌裂解物研制的疫苗,发现可提高临床型乳房炎的自愈率,但对降低乳腺内再感染效果并不确实。应用 3种噬菌体型金黄色葡萄球菌与α及β毒素组成的疫苗免疫奶牛,结果表明,该疫苗可以降低奶牛乳房炎发生率,却不能提高自愈率,不能提供有效的保护。

核糖体是一种胞浆颗粒。用核糖体制备菌苗对金黄色葡萄球菌和链球菌感染都具有防御作用,可诱导交叉血清型保护,并具有毒性小、效力强等优点,该菌苗已经被推广到生产实践中,起到了很好的免疫效果。MASTIVACⅠ是从临床和亚临床奶牛乳房炎病例中分离的含有3种血清型金黄色葡萄球菌(VLVL8407,ZO3984和BS449)的灭活苗。LeitneraG等[5]试验证明,这种疫苗对金黄色葡萄球菌性乳房炎有较强防御作用。Lubashevsy B等[6]采用 452头荷斯坦奶牛试验证明了 MASTIVACⅠ疫苗能够非特异性的改善乳腺健康状况,使产奶量明显增加。

Wubshet等[7]报道,含金黄色葡萄球菌纤维素结合蛋白 (FnBP)的血清对金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎有调理作用。Lulzim Shkreta等[8]对金黄色葡萄球菌 DNA疫苗进行了研究,指出了 FnBP和聚集因子 A(Clf A)是葡萄球菌性奶牛乳房炎发病机理中的重要蛋白。金黄色葡萄球菌 DNA疫苗是由 FnBP的 D121～34,D320～33和 Clf A的 aa 221 550基因片断为模板扩增的菌体质粒 (pC I D 1D 3 I RESClf A)构成。另外疫苗中还含有诱导编码颗粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因(pCI-bGM-CSF)的质粒,使机体的重组细胞 D 1D3和 Clf A蛋白含量增加,诱导机体淋巴细胞的生成,产生抵抗D 1D3和 Clf A的功能性抗体。临床实践证实,此 DNA疫苗对奶牛金黄色葡萄球菌有很好的保护性,安全性高[8]。

1.2 金黄色葡萄球菌苗的发展方向

葡萄球菌细胞壁上的抗原结构比较复杂,含有多糖和蛋白质两类抗原。金黄色葡萄球菌的多糖为抗A型,化学组成为磷壁酸中的核糖醇残基。由于多糖抗原有其特异性,所以常用多糖抗原制备疫苗。金黄色葡萄球菌荚膜多糖具有抗吞噬性,是金黄色葡萄球菌的致病因子之一。金黄色葡萄球菌荚膜多糖有特殊的血清型,荚膜产生的抗体有利于白细胞介导的调理素细胞吞噬的杀伤作用,杀伤金黄色葡萄球菌,提高机体对金黄色葡萄球菌症的免疫能力。现阶段的疫苗研究主要集中于金黄色葡萄球菌荚膜多糖1,2,5,8和336等5种血清型抗原上。其中前 4种抗原的生物学特性已被证实,336的血清型抗原的化学结构和生物学特性还不清楚。这 5种血清型抗原的噬菌体是非特异性的,以往几十年的研究中,在临床和免疫学上都没有找到特异性的噬菌体。试验发现,血清型 336的抗原不仅出现在无荚膜葡萄球菌上,而且也出现在血清型 5和血清型 8的菌株中[9]。今后的疫苗研究要着重筛选含有共同抗原的菌株来制备疫苗,增加疫苗的保护范围[6]。

2 大肠杆菌苗

埃希氏大肠杆菌是引起奶牛急性和亚急性乳房炎的主要环境病原菌,其细胞壁脂多糖(LPS)由内向外分别为菌体Ag层、寡糖层和脂质A层。一些粗糙型细菌核心Ag暴露在外,故能制作菌苗,刺激机体产生抗体,能杀灭许多革兰氏阴性菌;由于核心Ag属于碳水化合物,故免疫期较短。大肠杆菌的主要抗原有 O,K,H等 3种,它们是大肠杆菌血清型鉴定的物质基础。尿道致病性大肠杆菌 (Uropathogenic E.coli UPEC)是常见的牛乳房炎致病菌,它最常见的 O抗原群为O 2,O 8,O 21,O 81和 O 86,毒力因子为 Curli菌毛[10]。

2.1 现有的大肠杆菌疫苗

大肠杆菌疫苗目前研究和使用最多的是E.coli.J-5菌苗。该菌苗是一种缺乏尿苷二磷酸半乳糖异构酶的大肠杆菌突变体,不能将外源性半乳糖转移到革兰氏阴性菌细胞壁内的葡萄糖上,影响脂多糖的合成,从而造成各种寡糖的缺乏。另外 E.coli.J-5拥有不完全O-多糖,其特征是脂多糖的核心区和脂质A区抗原是裸露的。裸露的核心抗原刺激抗G-菌核心抗原的 Ig的产生,能保护多种肠杆菌的感染[11]。

Smith等用大肠杆菌J-5制成疫苗。E.coli.J-5菌苗由 5mL灭活菌体(109/m L)与 5m L弗氏不完全佐剂混合而成,通常采用皮下 3次免疫接种(泌乳末期第 14天,干奶期第 7天,干奶期第 30天)[12]。E.coli.J-5菌苗免疫可提高血清和牛奶中抗 E.coli.J-5核心抗原的抗体效价。Hogan等[13]认为,在干奶期间 E.coli J-5菌苗具有保护力是由于血清和牛奶中的抗 G-菌体抗原的 IgG和 IgM效价的升高,从而减轻了细菌感染的临床症状。并能交叉抵抗其他血清型的E.coli.J的感染,产生其他肠杆菌抗原的抗体。Smith等[12]试验证明,奶牛乳腺内免疫后牛奶中 IgG和 IgM效价比皮下免疫更高,在泌乳 21 d时乳腺内免疫奶牛的血清 IgM效价高于皮下免疫。虽然乳腺内免疫不会使肠杆菌性乳房炎临床症状减轻,但E.coli.J-5菌苗在 2次皮下注射之间进行乳腺内免疫比 3次皮下注射免疫产生更高效价的 IgG和 IgM。Reinhard t等用 1,25-双羟基 D 3作为佐剂,代替E.coli.J-5菌苗中的弗氏不完全佐剂,发现血清中 IgM,IgG和 IgA效价明显提高,并能有效防止使用弗氏不完全佐剂造成注射部位出现肿胀现象[14]。Enviracor J-5乳房炎疫苗由法玛西亚公司生产,1993年在美国使用[15]。现在在美国,防治大肠杆菌型乳房炎疫苗已经商品化生产,市场上有 3种商品化大肠杆菌乳房炎疫苗,它们的商标分别为:J-5Bacterin(J5苗),Mastiguard.TM和Endovac-Bovi。所有大肠杆菌乳房炎疫苗生产中都采用革兰氏阴性菌 (大肠杆菌)共同核心抗原制造可以防止多种革兰氏阴性菌的感染。大肠杆菌在乳腺内的增殖与乳腺内游离的三价铁离子的关系密切,大肠杆菌的生长和增殖离不开三价铁离子,最近研究的 E.coli.J5疫苗结合了柠檬酸三铁感受因子 A(FecA),增加了疫苗的效果。试验证明,免疫后能够刺激奶牛机体免疫球蛋白 G(IgG)的分泌,提高了大肠杆菌性乳房炎的自愈率[16]。

3 链球菌疫苗

引起奶牛乳房炎的链球菌主要是无乳链球菌(S.aga lactiae)、停乳链球菌 (S.dysalactiae)和乳房链球菌 (S.uberis),3种菌的形态相似,直径为 0.5～1.0μm。3种菌感染的奶牛乳房炎,均不产生明显的免疫,所以目前也无可靠的多价菌

苗[10]。

3.1 现有的链球菌疫苗

关于链球菌的疫苗研究的较少,主要是无乳链球菌和乳房链球菌,但效果都不理想。使用甲醛灭活后的无乳链球菌对奶牛无保护力;将甲醛灭活的乳房链球菌直接注入干奶期奶牛的乳房内,结果表明,在产犊后 2个月牛奶中仍可检测到 IgGI和 IgA抗体。Poutrel等指出蛋白 X(一种绝大多数奶牛链球菌乳房炎菌株拥有的蛋白)与 B族链球菌荚膜多糖耦联组成的疫苗能诱导产生调理性抗体。FinchM J等利用乳房链球菌 0140J活疫苗分别由皮下和乳房灌注的方法对健康奶牛进行免疫,然后分别用乳房链球菌 0140J和 C 221攻毒,结果表明,乳房链球菌活疫苗对同源的病原菌引起的乳房炎有一定的保护力,但是对异源的病原菌保护力较差,特异性强,而且指出皮下注射配合乳房内灌注的方法能增强疫苗的保护力。

在 Finch等的试验中,用乳房链球菌的灭活苗反复免疫奶牛,可降低牛奶中的细菌数。但不能降低牛奶中的体细胞数。Giraudo等的一个田间试验中采用了乳房链球菌和停乳链球菌多联灭活苗,接种疫苗并不能显著降低奶牛由链球菌引起的乳房炎的发生。到目前为止还无有效预防链球菌性乳房炎的商品化疫苗面市。

3.2 链球菌苗的研究方向

无乳链球菌是一类导致奶牛乳房炎的重要病原菌,可以引起奶牛乳腺严重的炎症反应,Michael等用血纤维蛋白溶酶受体蛋白 (GapC)的基因编码乳房链球菌和无乳链球菌细胞表面相关的 GapC蛋白,但试验证明,GapC的基因工程疫苗免疫后只对乳房链球菌乳房炎有保护性,而对无乳链球菌乳房炎无保护性,说明 GapC基因工程疫苗缺乏种间交叉保护性[17]。GapC和 αM IgG IgA复合物蛋白 (Mig),是由无乳链球菌 SDG 8菌株分泌的 2种蛋白,GapC与血纤维蛋白溶酶复合物蛋白(Plr)有 99.4%相同序列,Mig是位于SDG 8表面的一种蛋白。应用 GapC和Mig重组苗免疫奶牛后,检测乳汁中体细胞的含量,两者都能使乳汁中体细胞的含量降低,但是 GapC苗能使SDG8含量明显降低,而 Mig苗却没有降低。此方面的机理还不很明确,有很大的研究空间[18]。

当前,研究微生物和宿主相互作用的技术,已发展到以基因组为基础的 cDNA微点阵和蛋白质组技术水平。蛋白质组技术由于其无转录后和翻译水平的修饰问题而比 cDNA微点阵技术更实用于对完全基因组进行假定疫苗候选物筛检。蛋白质组技术包括双相 (2D)凝胶电泳技术对蛋白进行分离和显影,以及通过质谱分析 (MS)或 N端氨基酸测序法对蛋白斑点进行鉴定。在 2D凝胶中通过第 1相,使蛋白变性并根据其电荷量分离,随后用 SDS处理使所有蛋白带负电荷,这样就可以在第 2相中根据蛋白质量大小进行分离。通过 MS或 N端氨基酸测序法对蛋白斑点进行鉴定,并与已知病原体的基因组序列进行同源性分析。对每一组分的免疫原性检测,可用感染过疾病的宿主血清作探针,对蛋白斑点进行 Western blot分析。然而,这些蛋白的生物学意义和生理功能还需通过进一步分析加以验证[10]。近年来,已通过采用这种方法对一些细菌病原体进行了分析。在对化脓性链球菌的研究中,从培养上清中得到了 66个蛋白斑点,从中确认了 53条特异序列和 44种不同的蛋白质。这些蛋白中的大部分对已感染患者的血清均呈现免疫原性,该工作对化脓性链球菌和宿主相互作用在分子水平上提供了新信息。

4 奶牛乳房炎多联苗

国内研究的奶牛乳房炎疫苗多是乳房炎多联苗。罗金印等在“七五”、“八五”期间,对我国进行了奶牛乳房炎主要病原菌区系调查及其抗原性研究,并初步研制了奶牛乳房炎多联苗 A,B,C三种,罗金印等[19]从兰州、青岛、天津、重庆、西安、银川和西宁等地的病牛乳中分离出的病原菌,经培养、生化鉴定,选出生化反应典型、毒力强的菌株,通过免疫原性检测菌种为金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌的多联苗 (A)。经试验,选健康泌乳牛 1 652头,其中注苗组760头,对照组 892头。注射组比对照组乳房炎发病率降低 44.195%,具有很好的保护效果和明显的临床免疫效果。我国兰州兽医研究所研制的奶牛乳房炎多联苗(金黄葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌),疫苗经后海穴注射比肌注免疫效果提高 23%,注苗后无乳链球菌抗体含量最高,其次为金黄葡萄球菌和停乳链球菌,对链球菌引起的乳房炎有一定的免疫作用[20]。国外也有疫苗配合使用的报道,Sheik等运用 E.coli.J-5疫苗配合改良的都柏林沙门菌活疫苗来免疫新生乳牛,对乳房炎起到了很好的保护作用[21]。

5 展 望

奶牛乳房炎是由多种非特定的病原微生物引起的乳腺组织炎症。至今尚未有彻底解决的办法。在整体上控制奶牛乳房炎的发生,预防是重中之重。综合国内外研究成果及结合国内奶牛养殖业的具体问题,奶牛乳房炎的预防主要是疫苗接种,搞好环境和牛体卫生,采取适当的挤奶卫生措施,定期检查,干奶期治疗所有的乳区,加强饲养管理,增强奶牛体质,减少外伤因素,防止其他疾病的继发等[22]。奶牛乳房炎疫苗的研制和开发对奶牛乳房炎的防治有着广阔的前景。

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(责任编辑:石瑞珍)