免疫胶体金技术及其应用

齐颖颖

（河北省科学院生物研究所，河北石家庄 050081）

免疫胶体金技术及其应用

齐颖颖

（河北省科学院生物研究所，河北石家庄 050081）

免疫胶体金技术近年来发展迅速，应用范围极广。本文综述了免疫胶体金技术原理、制备方法及其广泛应用，分析了存在的问题，并针对其存在问题提出展望。

免疫胶体金技术；制备；应用

免疫胶体金技术（ICG）是以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，在光镜电镜下对抗原或抗体物质进行定位，定性乃至定量研究的标记技术。1962年Feldherr第一次介绍了胶体金可作为一种电子显微镜水平的示踪记物。1971年，Faulk和Taylor［1］首次用免疫金标技术研究沙门氏菌壁细胞抗原成分，将胶体金与抗体结合用于电镜水平的免疫细胞化学研究，这一年被公认为免疫胶体金技术诞生年。1974年Romano EL等将胶体金属标记在马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染色法。1974年Bauer H等报道凝集素－金复合物的应用。1978年Geoghe－gan WD等应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原。1981年Danscher G用银显影方法增强胶体金颗粒的可见度，提高了灵敏度。1983年Holgate［2］CS将银显色技术与免疫金染色法相结合，建立了免疫金银染色技术（Immunogold－silver staining，IGSS）。1986年Fritz P等在免疫金银法基础上成功地进行了彩色免疫金银染色，使得结果更加鲜艳夺目。近年来，根据胶体金的物化性质，进一步拓展了基于胶体金标记的生物检测技术及胶体金在其生物学方面的广泛应用。

1 免疫胶体金技术的基本原理

免疫胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应中的一种新型免疫标记技术。胶体金（Colloidal gold）是由氯金酸（HAuC14）水溶液在还原剂作用下，聚合成特定大小的金颗粒，颗粒之间因静电作用形成一种稳定的胶体状态，也称金溶胶（Gold so1）。利用胶体金在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团籍静电吸引而形成牢固的结合，这种结合对所标记蛋白质的生物活性无明显影响。除蛋白质分子外，胶体金颗粒还可以与其他多种生物大分子物质（如毒素、抗生素、激素、核酸、多肽缀合物等）结合。

2 免疫胶体金的制备

2.1 胶体金的制备

用还原法从氯金酸溶液中制备不同粒径（5～150nm）［3］的胶体金颗粒。胶体金的粒径不同会呈现不同的颜色。常用的制备方法有白磷还原法、抗坏血酸还原法、柠檬酸三钠还原法、鞣酸一柠檬酸三钠还原法、乙醇超声波还原法和硼氢化钠还原法［4］。其中最常用的制备方法为柠檬酸三钠还原法，将0.01%的氯金酸溶液加热至沸腾，快速搅拌的同时迅速加入1%的柠檬酸三钠水溶液，继续加热，溶液颜色由浅黄色逐渐变为浅蓝色、蓝色、蓝紫色、紫红色，最后变为澄清透明的酒红色。此法制备程序简单，胶体金的颗粒形状、大小较均一［5］。

2.2 胶体金标记蛋白的制备

是蛋白质等生物大分子物质被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。在免疫组织化学中，将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针，用于免疫测定时多简称为免疫胶体金（immunogold）。最好在标记前测定形成稳定胶体金一蛋白质复合物的最小蛋白质需要量［6］以及最佳p H值［7］。用K2CO3调胶体金的最佳p H值，再加入适量抗体，稳定剂［8］，最后制备好的胶体金一蛋白质复合物需进一步纯化，以除去未结合的蛋白质或胶体金颗粒，一般采用超速离心法。

3 免疫胶体金技术

3.1 免疫渗滤试验（DIFA）技术［9］

其基本原理是以微孔膜为固相载体，包被已知抗原或抗体，加入待测样本后，经微孔膜的渗滤作用或毛细管虹吸作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金标记物（或其他）指示剂之反应形成红色的可见结果。

3.2 免疫层析［10］（immunochromatography）试验技术

其原理是将特异的抗体或抗原先固定于硝酸纤维素（NC）膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品尿液或血清后，由于毛细作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体或抗原的区域时，样品中相应的抗原或抗体即与该抗体或抗原发生特异性结合，再通过标记技术使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。胶体金免疫层析（GICA）就是利用胶体金本身的显色特点结合免疫层析技术诊断特异性的待测物。同样是层析法的金标纸条，根据胶体金标记的东西不同可以分成间接法、竞争法和双抗原夹心法等不同种类。

4 免疫胶体金的应用

4.1 免疫胶体金标记技术在植物方面的研究应用

4.1.1 植物病害超微病理的研究［11］

利用免疫电镜技术研究植物病害的超微病理，其原理是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨率相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析。特异性抗体用铁蛋白、胶体金或过氧化物酶标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物的所在位置，即为抗原抗体的反应部位。2002年，李红叶［12］等利用免疫胶体金标记技术检测寄主体内的葡萄扇叶病毒（Grapevine fanleaf virus GFLV）移动蛋白，进一步证实了GFLV是通过管状结构实现细胞问移动的。彭日荷［13］等同样利用此技术研究了甜菜多粘菌传带甜菜坏死黄脉病毒的部位。

4.1.2 植物病害的快速检测

利用胶体金免疫层析法和斑点渗滤法可准确、灵敏、快速地检测植物病害，并具有操作简便的特点，克服了传统鉴定方法时间久、操作程序复杂、无法及时诊断潜伏侵染的病害等缺点。

4.1.3 植物－病原物互作的研究

利用基因芯片技术植物－病原互作的分子机制，尤其是在检测与病害发生发展有关的植物－病原物互作基因方面有着美好的前景。基因芯片技术是指通过微阵列技术将告密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，标记DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。利用胶体金标记寡聚核苷酸，制备DNA探针，应用于基因芯片技术。将捕获DNA固定到玻片基质上，加入胶体金标记寡聚核苷酸探针，如互补则可发生特异性结合，经银加强技术后，通过显微镜或肉眼可直接观察到结果。

4.1.4 转基因植物产品的检测

以转基因植物中外源目标基因表达的产物为抗原，制备其特异性抗体，用胶体金标记抗体，制作免疫层析试纸条或斑点渗滤试剂盒，可快速、灵敏地检测转基因植物产品，并可通过定量或半定量技术初步鉴定其质量。

4.1.5 胶体金免疫在植物检疫上的应用

由于以膜为固相载体的免疫胶体金快速诊断技术即免疫层析技术和斑点渗滤技术可检测各种细菌、真菌、病毒等植物病害，且具有快速、灵敏、特异性强、操作简便可大批量地检测样品等优点.可用于跨区域引种、调种及海关的植物检疫。

4.2 免疫胶体金在动物方面研究应用

4.2.1 免疫胶体金在病毒害检测中应用

胶体金免疫层析技术在动物检疫工作中广泛用于诸如猪瘟、蓝耳病、细小病毒病等传染病病源微生物的抗原、抗体检测，也可用于一些违禁和超量使用激素如性激素残留的检测。此外，该技术还可用于其它一些微量物质的检测，如抗生素残留检测等。胶体金免疫层析作为一种可靠的免疫学检测技术，特异性强、灵敏度高、简便快速、无需特殊仪器设备，在动物检疫实际工作中有广泛应用价值。

4.2.2 免疫胶体金技术在禽病［14］诊断中的应用

随着世界范围内养禽业的规模不断扩大，禽病对养殖的危害也随之加剧。对家禽疾病进行有效防治的关键是快速准确地进行诊断并弄清致病因子。伴随着病原检测技术的进步，免疫胶体金技术以其快速，简便，可单份检测，灵敏度高，特异性强，稳定性好，检测标本种类多等优点开始被逐渐应用于禽病的病原诊断。例如：王长美等用免疫胶体金试验诊断－发病率高、死亡快、疑似禽I型副粘病毒感染的鹅病例 结果为禽流感阴性，根据临床症状和病变情况、免疫胶体金试验以及病毒分离和鉴定，证明该鹅群患禽I型副粘病毒病，实现了对禽1型副粘病毒病的快速鉴别诊断。

4.2.3 昆虫病理学研究

利用免疫胶体金标记技术同免疫电镜技术、基因芯片技术等实验技术结合将会给在组织细胞学、分子生物学水平上阐明昆虫病理的本质问题带来光明的前景。

4.2.4 介体传毒识别传毒机理的研究

以免疫胶体金为标记物的组织细胞学定位技术研究病毒－介体互相识别的分子细胞学过程，可揭示介体识别传毒专化性的分子机理，为植物抗病毒生物工程及用药物处理病毒受体的介体途径防治病毒病提供科学依据。

4.3 免疫胶体金快速检测技术在临床中的研究应用

早孕诊断［15］用的免疫层析试纸条（通常又叫尿妊纸条）是一个成功的例子，Hasan等人用免疫层析法检测粪便中的霍乱弧菌，得到了理想的效果。王中力等人用自制的犬细小病毒（CPV）试纸条检测CPV抗原，具有简单、快速、准确等优点。李兆隆等［16］研制了检验人精浆特异蛋白P30的免疫胶体金试纸条，主要用于法医物证检验。曲萌等［17］采用胶体金标记鼠抗人Ig M单克隆抗体制成免疫层析试纸条，检测肝炎病毒Ig M抗体。

4.4 免疫胶体金在生物传感器上的研究及应用［18］

近年来金标记被引入生物传感器中的应用研究增多。Kim J H等通过交流电导法检测了在叉指电极上的金标记的免疫凝集，从而实现了胶体金免疫层析试验的电化学检测方法，并且通过在胶体金上包被导电聚合物聚苯，提高电导法测定金标免疫反应的灵敏度。2003年Brainina K等在标记胶体金标记A蛋白的基础上，制作了诊断森林脑炎的电化学免疫传感器 检测血清中的森林脑炎抗体及其浓度，应用胶体金催化性质的修饰酶生传感器的电极表面。TangD等基于铂金电极修饰的胶体金提高了生物传感器检测HABS表面抗体敏感性和稳定性。Kitano H等用基于胶体金表面等离子共振效应的电感受器测定胃蛋白酶的亲和常数。

5 免疫胶体金技术存在的问题及应用展望

存在问题：（1）胶体金颗粒大，渗透能力相对较差；（2）在操作过程中要求清洁程度高；（3）胶体溶液的稳定性较差，这些问题导致免疫胶体金技术的应用受到一定限制。

免疫胶体金技术是基于酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、免疫胶体金技术［19］和新材料技术的新型技术，具有便捷、灵敏、安全、低成本等特点，在诊断领域中迅速推广，已日趋成熟。免疫胶体金技术目前和今后的研究趋势有3个方面：①进一步提高检测灵敏度［20］；②实现检测多元化可采用在同一膜上作多种项目测定和多项目的组合测定2种方式，一次检测可同时得到一组结果，这对于检测某些具有联检意义的物质具有很大的应用价值；③实现定量或半定量检测［21］。

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Immune colloidal gold technique and its applications

QI Ying－ying

（InstituteofBiology，HebeiAcademyofSciences，ShijiazhuangHebei050081，China）

Immune colloidal gold technique has developed rapidly in recent years，and applied range field of applications.This paper summarizes the technical principles，preparation methods，widely usage，analyzes and proposes of the existing problems.In addition，it analyses the existent problems and raises prospects on those problems.

Immune colloidal gold technique；Preparation；Application

Q78

：A

1001－9383（2011）04－0036－04

2011－06－30

齐颖颖（1988－），女，河北省沧州人，主要从事细胞生物学研究.