茶多糖的提取及分离纯化研究进展

崔宏春 余继忠* 黄海涛 周铁锋 郑旭霞 师大亮 郭敏明 江和源 江用文

(1.杭州市农业科学研究院茶叶研究所 杭州 310024;2.中国农业科学院茶叶研究所 杭州 310008)

茶叶起源于中国，是中国古代文献记载中被提及最早的天然药物之一。茶叶最早是作为一些有毒草药的解毒剂，在中国和日本民间曾有常饮用粗老茶来治疗糖尿病的经验[1-3]。据大量文献报道，茶叶具有广泛的药用价值和营养价值，其生物活性与茶叶中所含的活性成分密切相关。

茶多糖是继茶多酚后从茶叶中提取出来的、具有多种生物活性、组分复杂的茶叶天然活性物质。近几十年的研究发现，茶多糖的较突出功效是降血糖、降血脂[4-5]，并且在防治糖尿病[6]、抗凝血、防血栓形成[7]，保护血相和增强人体非特异性免疫能力等方面也具有明显功效[8-10]，是一种极具应用和开发前景的天然产物，可广泛应用于食品、医药、保健等领域。随着对多糖研究的日益深入，特别是自发现茶叶降血糖有效成分主要是水溶性组分中的多糖复合物以后，茶多糖的提取、分离纯化、分析检测等方面研究越来越引起人们的关注，国内外学者也对其进行了较为广泛而深入的研究，本文就近年来茶多糖的提取及分离纯化研究进展作以综述。

1 茶多糖的提取

茶多糖在生理pH条件下带负电荷，主要为水溶性，且易溶于热水，但不溶于高浓度的有机溶剂，热稳定性差，高温、过酸或偏碱的条件均会使其部分降解而丧失生物活性。因此，茶多糖的提取应避免在强酸强碱溶液中进行，否则极易促使茶多糖的糖苷键断裂及发生构象变化，从而降低甚至失去生物活性。茶多糖提取的方法有水提法、酸提法、碱提法，以及一些辅助提取法，如微波辅助提取法、酶辅助提取法和超声波辅助提取法等[11-15]。酸提法和碱提法对提取条件要求较高，因此这两种提取法及相应的辅助提取法应用相对较少。当需要使用这两种方法提取茶多糖时，特别应该注意的是，采用稀酸提取，时间宜短，温度不宜过高;采用稀碱提取，应在氮气中进行，防止多糖降解。目前，应用较多的茶多糖提取方法主要是水提法，本文着重对茶多糖的水浸提法作以综述。

1.1 水浸提法

水提取法因操作简便、实用性强，而被广泛应用，并且其辅助提取法也被广大学者应用与研究。茶多糖的水提取法，通常是将茶叶磨碎，然后采用有机溶剂浸泡法，脱除部分小分子色素，再用水浸提，或者不使用有机溶剂，直接使用水浸提。

黄杰等[19]研究了浸提温度、浸提时间、料液比对茶多糖得率、茶多糖含量及蛋白质含量的影响，得出较佳的茶多糖提取工艺，浸提温度宜在55℃，浸提时间宜为3 h，料液比达到1∶25即可。王黎明[20]采用二次响应面分析法，得出水提取茶多糖的较佳提取条件为温度70℃，浸提时间1.5 h，料液比为1∶10，浸提3次。周小玲[21]也采用二次响应面分析法，得出较佳的提取条件为提取温度80℃，浸提时间1.5 h，料水比1∶20。综合前人研究成果，茶多糖常用的水提工艺参数为，95%乙醇浸泡(可选的工艺)，55℃ ～100℃水浸提，浸提时间1 h～3 h，料液比 1∶10 ～1∶30[16-18]。

1.2 茶多糖提取新技术

随着化工仪器和食品加工技术的发展，越来越多的新技术和新仪器开始应用到茶多糖的提取中。酶法辅助提取、微波辅助提取及超声波辅助提取是近年来应用在茶多糖提取的新技术，与传统的水提法相比，较大的提高了茶多糖的得率，提高了资源利用率。

酶工程技术是用于天然植物有效成分提取的一项新型生物工程技术，选用合适的酶，可在常温常压条件下即可将植物组织分解，加速有效成分的释放，从而提高得率。在茶多糖酶法辅助提取中，应用较多的酶为蛋白酶、果胶酶、纤维素酶，除此外还有应用茶叶水解酶、胰酶以及一些复合酶。王元凤等[22]将复合酶和果胶酶用于茶多糖的提取，使得茶叶细胞壁破裂，促进多糖的溶出，使茶多糖提取率达到了2.21%。周小玲等[23]采用果胶酶、胰蛋白酶和复合酶提取崂山粗老绿茶中的茶多糖，发现复合酶提取法的提取率最高，但果胶酶法的总糖含量最高。而郭艳红等[24]研究茶叶水解酶、戊聚糖酶、纤维素酶和葡聚糖酶酶法辅助提取茶多糖得率，发现质量分数为0.8%的茶叶水解酶，在 pH 值 5.5、温度 48℃的条件下，茶多糖含量最高，得率为2.01%。

微波技术应用于茶多糖提取，既可以提高茶多糖得率，又可以降低成本，从而提高经济效益。张忠等[25]利用正交试验研究微波辅助提取茶籽多糖的提取条件，得出最佳提取条件为。浸提功率400W，固液比1:30，pH为5，浸提时间30S。聂少平等[26]研究得出微波辅助提取法与酶法辅助提取法、水提取法相比，具有时间短、得率高的优点，是茶多糖提取的一种优选方法。此外，汪兴平等[27]研究微波辅助提取法对茶多糖、咖啡碱结构的影响，发现其对茶多糖和咖啡碱制品的化学结构并无影响。

超声波辅助提取主要是利用超声波在液体中的空化作用加速植物细胞破碎，使有效成份浸出提取，具有高效、适用性广、条件温和等优点[28]，为植物功能成分提取提供了一种快速、高效的新方法。巩发永等[29]利用正交试验，研究超声波辅助提取边茶中茶多糖的提取条件，得出最佳提取条件为超声波功率360 W、料液比1∶50、浸提时间35 min、浸提温度45℃。而安卫征等[30]也采用正交试验研究超声波辅助提取普洱茶多糖的最佳提取条件，发现功率800 W，料液比1∶50，时间25 min，多糖得率较高。两者的超声波辅助提取最佳条件差别较大，可能是后者正交试验时没有把温度作为一个因素，另一方面是两者用的原料不同。

2 茶多糖的分离纯化

通过水提法、酸提法、碱提法等方法提取得到的只是茶叶粗多糖，为了得到纯度更高的茶多糖，必须去除与其分子质量相差不大的水溶性物质、色素、脂类、低聚糖等杂质。粗多糖分离纯化的一般步骤为“脱蛋白→脱色→分级，或者分离(初步分级)→脱蛋白→脱色→进一步分级”，并且脱蛋白和脱色顺序可以颠倒，组分分级可以多种方法联合应用。

2.1 脱蛋白

粗多糖中含有大量蛋白等杂质，汪东风[32]和李布青[31]等证实茶多糖是一类与蛋白质结合在一起的酸性多糖或一种酸性糖蛋白，而且茶多糖中游离蛋白质的碱性氨基酸会与多糖链上的酸性基团产生静电结合，使蛋白质和多糖结合更紧密。一般常用的脱蛋白法有Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯乙酸法。Sevag法的条件较为温和，可避免多糖的降解，缺点是一次只能除去少量蛋白质，需要多次反复才能去除尽，多糖常因多次除蛋白处理而损失。三氟三氯乙烷法效率较高，但因其易挥发，不宜大量应用。三氯乙酸法脱蛋白效果较好，但此法较为剧烈，会引起某些多糖的降解，使得率降低，并且据报道该法还会影响茶多糖的活性。但因其操作简便、适用性较强，目前此法在茶多糖脱蛋白中应用较广。

2.2 脱色

茶叶中含有的色素种类较多，但对茶多糖提取分离影响较大的主要是多酚类物质，多酚类物质极易氧化，并且氧化后颜色加深。色素物质加重了茶多糖产品的色泽，严重影响着茶多糖的结构分析、作用机理及构效关系等研究，因此对提取的粗茶糖必须进行脱色处理。常用的脱色方法主要有物理吸附法和氧化法，其中物理吸附法包括活性炭脱色法和大孔吸附树脂法，而氧化法包括双氧水脱色法以及离子交换法中的纤维素柱层析脱色。

活性炭脱色法主要原理是依靠范德华力将色素吸附到活性炭表面，活性炭的颗粒愈小，其表面积愈大，吸附能力愈强，粗茶多糖的脱色效果愈好。但活性炭脱色样品损失较大，对于从动植物中提取的天然多糖，由于本身含量量就不高，所以一般不用活性炭脱色法处理[33]。大孔吸附树脂法脱色效果虽好，但操作繁琐，树脂易污染，成本较高。

纤维素柱层析脱色法是近年新发展起来的一种脱色方法，不仅具有脱色作用，而且可以去除茶多糖粗提物中的残余茶多酚，对茶多糖进行初步分级，但其适合于处理量小、黏性小、色素含量较小的体系，否则易造成纤维素填料污染，再生困难，并且纤维素填料成本较高，生产周期较长。纤维素柱层析一般选用DEAE做交换剂，适合分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖，吸附力随多糖分子中酸性基团的增加而增加。江和源等[34]采用DEAE-52纤维素对茶多糖进行脱色分级纯化，得到TPS1-H2O、TPS1-0.25和TPS1-0.40三个组分的茶多糖，对应洗脱液分别为 H2O、0.25 mol/L NaCl和 0.40 mol/L NaCl。

双氧水脱色法的脱色原理是依赖双氧水在水溶液中电离出的过氧化氢根离子HO2－去进攻色素的结果。在酸性和碱性介质中，能起漂白作用的HO－2离子浓度很低，漂白作用很差，加入弱碱后，电离度增大，即双氧水被活化，漂白作用增强，分解速度加快。分析个中原因，主要是因为在加入弱碱的条件下，双氧水容易分解形成HO2－，而 HO2－是一种亲核试剂，易引发过氧化氢分解，产生游离基，游离基一旦与茶叶中的色素发生作用，便可使之脱色。笔者[35]曾采用正交试验研究茶多糖双氧水脱色的实验条件，综合脱色效果及多糖得率得出最佳条件为5 ml H2O2、温度 30℃、pH 7.0、脱色 5 h。

2.3 茶多糖组分分级

2.3.1 初步分级 粗多糖组分初步分级的方法有分步沉淀法，季胺盐沉淀法，超滤法。分步沉淀法是根据不同性质以及不同分子量的多糖在不同浓度的乙醇或丙酮中的溶解度不同，从而分离得到某一性质或某一分子量的多糖.此方法适宜于分离溶解度相差较大的多糖。季胺盐沉淀法的主要原理是利用长链季胺盐能与酸性多糖形成水不溶性化合物，从而分离得到酸性及中性多糖，但须严格控制混合物的pH值小于8，以及无硼砂存在，否则中性多糖也会沉淀出来，且酸性强或分子量大的酸性多糖首先沉淀出来。常用的季胺盐是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)及其碱(CTA－OH)和十六烷基吡(CPC)。杨其林等[36]利用正交试验得出CTAB沉淀茶多糖的最佳工艺条件为:离心时间12 min，CTAB浓度0.05 g/ml，加入量 25 ml，沉淀时间 6 h。

超滤法是利用不同孔径的超滤膜允许不同分子量的物质通过，使样品溶液通过已知膜孔径的超滤膜从而分离得到茶多糖组分。该方法既避免了制备过程中各成分的互相干扰，提高了茶多糖产品的纯度，又节约了处理成本，而且整个过程不引入有毒的有机溶剂，设备操作简便，极具工业化应用前景[37]。1991年时，Kenichi I等[38]采用超滤法制备得到纯化的茶多糖组分。寇小红等[39]采用膜过滤法研究经过0.2 μm孔径膜处理后的茶汤滤液，再依次经过150 kD、20 kD、6 kD的膜组件进行分级和浓缩，结果表明，超滤膜分离处理对于茶多糖的分离纯化效果明显。尹军峰等[40]通过对不同孔径膜的筛选试验，确定50 K分子量的膜为富集茶多糖最好的膜。

2.3.2 精细分级 粗茶多糖经过脱蛋白、脱色以及初步分级处理，大部分杂质已经除去了。但因茶多糖并不是均一多糖，而是由多种分子量的组分组成的，若要进一步分析其组成、相对分子量、化学结构以及构效等，还需要对茶多糖进一步精细纯化分级。多糖进一步纯化分级的方法较多，主要有制备性高效液相色谱法、制备性区带电泳法、亲和层析法、离子交换剂柱层析法和凝胶柱层析法等。比较常用的茶多糖精细分级纯化处理方法主要是高效液相色谱法和柱层析法，本文着重对茶多糖柱层析纯化法作以综述。

常用的茶多糖柱层析纯化法有纤维素阴离子交换柱层析法和凝胶柱层析法。纤维素柱层析法一般用DEAE做交换剂，适合分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖，吸附力随多糖分子中酸性基团的增加而增加。凝胶柱层析法是利用凝胶的分子筛作用，根据多糖分子大小的不同进行分离。常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)、琼脂糖凝胶(Sepharose)以及丙稀葡聚糖凝胶(Sephacryl)。这三种凝胶都有不同的分子量范围，适合于分离具有不同分子量的样品。这两种柱层析都具有脱色和分级两种作用，其中纤维素阴离子交换剂柱层析脱色效果较好，凝胶柱层析分级效果较好。在多糖分级纯化过程中，为得到到茶多糖均一组分，一般先用纤维素阴离子交换柱层析对茶多糖进行初步脱色分级，所得组分再用凝胶柱层析进一步分级纯化。寇小红等[41]对经过150 kD、20 kD、6 kD超滤膜处理得到的茶多糖的滤液和截留液，分别用DEAE-52纤维素离子交换层析和丙烯葡聚糖凝胶Sephacryl S-300柱层析系统进行再分离和纯化，共得到了20多个茶多糖的分级组分。王元凤[42]用DEAE Sepharose FF柱层析系统把经过D315树脂脱色分离得到的多糖样品NTPS和ATPS，再纯化分级为四个组分，其中NTPS1、ATPS2、ATPS4为均一多糖。

3 展望

近20年来，由于生物化学、分析化学、植物学、医学等学科的飞速发展和交叉发展，人们对多糖及其复合物的提取分离、结构、生物活性等有了越来越深入的认识。茶多糖作为茶叶中功能成分中的一种生物活性物质，具有多种药理作用，其生产工艺已得到比较深入的研究，并且由于其制备的原料多为粗老茶叶，资源较丰富且价格低廉，其应用和开发前景非常广阔。

茶多糖的结构分析、药理作用、结构及分子修饰等研究，都依赖于茶多糖的提取及分离纯化技术的发展和进步。目前，高纯度茶多糖的制备在实验室里已经可以实现，但由于原料不同及提取分离纯化技术的不同，所得的高纯度茶多糖组分、结构等有所差别，这在一定程度上制约了茶多糖的结构解析、药用机理等研究。此外，在大规模工业化生产中，茶多糖提取和分离纯化工艺研究尚不够深入，如工艺流程繁琐、生产成本过高、生产设备落后等原因，造成目前市场上销售的茶多糖产品纯度较低，产品利润空间小，且严重影响茶多糖终端产品的开发。另外，在制备茶多糖的过程中，仍存在有大量使用机溶剂的问题，使茶多糖产品存在质量安全隐患，成为制约茶多糖相关产品开发的又一个瓶颈。新技术的引进与工艺参数的成熟化，多种提取技术和分离纯化方法的搭配优化，与茶多酚制备技术、咖啡碱制备技术等技术的结合与综合运用，绿色环保与低耗能低成本制备技术的研究等，这些将是茶多糖提取及分离纯化技术的未来研究热点与发展趋势。

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