高糖中膀胱ICCs超微结构的变化

范勇洪

作为膀胱舒缩活动的起搏和传导者，ICCs细胞在膀胱活动中起着关键作用［1］。其功能改变可能是造成膀胱功能障碍的原因。因此推测，DCP发病可能与ICCs改变有关。本研究通过单细胞培养、观察ICCs超微结构在高糖环境中的变化，探讨DCP功能改变的细胞生物学基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料 英国种健康豚鼠，透射电镜。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠膀胱ICCs细胞的体外培养和制备 脱臼处死豚鼠，无菌手术取出其膀胱，取肌层并剪成碎块，胶原酶V消化，制成无糖的DMEM细胞悬液于培养皿中，培养箱中培养24 h，弃去原液，分别加入5、10、15 mmol/L葡萄糖 DMEM 细胞培养液，继续培养24、72 h。胰蛋白酶消化，刮刀刮取ICCs细胞，高速离心，戊二醛固定细胞团。

1.2.2 电镜观察 细胞团经冲洗、固定、梯度序列丙酮浸泡脱水、聚合后，超薄切片，再醋酸铀、柠檬酸铅顺序染色后，切片置于透射电镜下，选图像清晰之ICCs细胞观察。

2 结果

ICCs细胞超微结构在高浓度糖环境中发生明显变化，随培养液中糖浓度升高及时间增长，ICCs细胞损害也就越明显。①5 mol组培养24和72 h组后，ICCs细胞无明显变化，镜下见核仁大而多，核浆比例大，线粒体丰富，胞突长而少。②10 mol组培养24 h则见核仁多，边集，核浆比例大，细胞内部细胞器减少，比如核糖体、内质网数量减少，内质网开始扩张，胞突变短，细胞内较多颗粒状类释放物存在，多位于胞突内，颗粒状物外有被膜。培养72 h后可见核仁大，数量多且形态不规则，核浆比例增大，细胞内部细胞器更少，细胞内颗粒状类释放物更多，位于胞突，并且有向外释放之势，胞突特别多且更短。③15 mol组培养24 h后可见细胞分散，不成片，细胞体积增大，其内颗粒状类释放物较多，也存在于胞突，细胞器也明显减少，胞突几近于消失。培养72 h后可见细胞不成片，细胞体积增大，核大，其内异染色质明显减少，胞浆内粗面内质网、线粒体数目极少，线粒体明显大小不一，游离核糖体增加，部分细胞膜局部呈现坏死灶，胞突完全消失。

3 讨论

众多科研成果提示ICCs细胞在膀胱活动的起搏器、传导器。膀胱不依赖神经以及体液因素可以自发的兴奋、收缩［2］，ICCs细胞可测到自发的电位变化［3］，尿路全程均有ICCs存在［4-6］。糖尿病最常见症状之一是DCP，其病变原因不明确。因此我们推测，ICCs细胞功能变化可能与DCP发病有关。可能是高糖破坏ICCs超微结构引起DCP的事发病。

本次研究用单种细胞体外培养，来观察高葡萄糖浓度下膀胱ICCs内部超微结构的变化。发现糖浓度升高及培养时间长，ICCs细胞内结构破坏就越明显。

图片对比可见，5 mol/L糖浓度没有影响ICCs细胞，胞内细胞器丰富，胞突少而长，即生理范围内的糖浓度不影响ICCs。10 mol/L经培养24和72 h后均明显出现细胞结构的破坏，核仁多，边集，核浆比例大，细胞内部细胞器比如核糖体、内质网数量减少，内质网开始扩张，胞突变短，细胞内较多颗粒状类释放物存在，多位于胞突内，颗粒状物外有被膜。而培养72 h后细胞结构破坏更明显，核仁大而多，且形态不规则，细胞内部细胞器更少，而颗粒状类释放物更多，并且有向外释放之势，胞突多且更短，呈绒毛状。推测高浓度糖刺激下，破坏ICCs内部超微结构，刺激ICCs细胞代偿性生理功能增强，造成其分泌颗粒如神经递质等增加。15 mol/L组细胞破坏更甚于10 mol组.培养24 h后细胞分散，不成片，细胞体积增大，颗粒状类释放物较多，细胞器也明显减少，胞突几近于消失。培养72 h后，细胞不成片，核内异染色质明显减少，粗面内质网、线粒体数目极少，线粒体明显大小不一，游离核糖体增加，部分细胞膜局部呈现坏死灶，胞突完全消失。过高的葡萄糖浓度刺激，短时间内可造成ICCs细胞代偿性功能增加，但培养时间增长，过高的葡萄糖浓度持续的破坏，使细胞能量来源的结构基础线粒体被破坏，粗面内质网上的核糖体脱落，造成ICCs细胞生理功能丧失或下降。

研究结果显示，ICCs功能及其结构的变化与高浓度糖的内环境有密切关系。内环境中糖浓度的升高、作用的时间长，则ICCs细胞结构及功能变化也就更明显。由此推测：高浓度糖破坏ICCs细胞的超微结构、胞突消失，造成该类细胞的起搏和传递中介的功能、结构变化，导致膀胱兴奋能力变化，膀胱逼尿肌舒缩能力产生变化，而使DCP临床症状出现。高糖中ICCs细胞的超微结构被破坏有可能是临床发生DCP的病理基础之一。

［1］Jiang HH，SongB，Lu GS，et al.Loss of ryanodine receptor calcium release channel expression associated with overactive urinary bladder smooth muscle contractions in adetrusor instability model．BJU Int，2005，96(3)：428-433．

［2］Andersson KE，Arner A.Urinary bladder contraction and relaxation;physiology and pathophysiology. Physiol Rev，2004，84：935-986．

［3］McCloskey KD.Characterization of outward currents in interstitial cells from the guinea pig bladder．J Urol，2005，173：(1)：296-301．

［4］Davidson R A，McCloskey KD.Morphology and localization of interstitial cells in the guinea pig bladder：structural relationships with smooth muscle and neurons．J Urol，2005，173(4)：1385-1390．

［5］McCloskey KD，Gurney AM.Kit positive cells in the guinea pig bladder．J Urol，2002，168(2)：832-836．

［6］Exintaris B，Klemm MF，Lang RJ.Spontaneous slow wave and ontractile activity of the guinea pig prostate．，J Urol，2002，168(1)：315-322．