大肠癌分子生物学特征—转化医学与临床应用研究

韩英 盛剑秋

北京军区总医院消化内科

大肠癌分子生物学技术及其转化应用研究在 CRC筛查和诊断方面具有重要临床意义。

1 大肠癌分子路径

大肠癌分子路径主要有三种：（1）染色体不稳定(CIN)路径：占全部散发性CRC病例的70%～85%以上；（2）CpG 岛甲基化表型 (CIMP) 路径：导致散发性CRC的另一条主要路径，包括高度MSI不稳定(MSI)所致的散发性CRC；（3）纯微卫星不稳定（MSI）路径：由于DNA错配修复 (MMR) 基因胚（种）系突变，例如遗传性非息肉病性大肠癌 (HNPCC) 。

参与CIN路径的基因异常包括：APC基因，KRAS基因突；TP53基因。APC或β-catenin基因突变频率，在腺瘤早期高达80%。APC基因突变的发现率，结肠癌约为60%，直肠癌约为82%。TP53 基因是腺瘤演变为腺癌的传统路径中的晚期事件；SMAD4蛋白胚系突变会导致幼年性息肉病综合征，此病和CRC有关。在CIN路径导致的CRC中，完全具备全部上述分子生物学异常者只占极少数。

MSI是一种重要的基因组不稳定路径。在肿瘤和胚系细胞DNA的微卫星区域内，核苷酸重复序列复制错误，因而造成不稳定性。复制这些短的重复序列时，DNA聚合酶非常容易出错，此种错配修复（MMR）功能障碍导致了MSI。MMR系统组成至少有7种蛋白，MLH1基因、MLH3、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1和PMS2，7种蛋白间特异性结合，形成功能性异二聚体（heterodimers）。MLH1和MSH2在错配修复机制中是不可或缺的，具有五种功能性异二聚体蛋白（heterodimeric proteins）（MSH2-MSH3，MSH2-MSH6，MLH1-PMS1，MLH1-PMS2，MLH1-MLH3）。

HNPCC与MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的基因突变有关。检测两种单核苷酸（BAT25和Bat26）和三种二核苷酸（D5S346、D2S123和D17S250）。MSI-高度不稳定（MSI-H）：上述5个检测位点中，MSI≥2（40%）；MSI-低度不稳定（MSI-L）：只有一个检测位点阳性；微卫星稳定（MSS）：5个检测位点均未发现不稳定性。

CIMP路径是散发性CRC的另一常见路径，约占散发性CRC的15%。CIMP路径中启动子区的甲基化异常，关键的抑癌基因（如MLH1）表达失活，导致表观遗传不稳定性，是散发性CRC的重要机制。CIMP阳性：3个以上的基因启动子位点PMR≥10。CIMP阳性与BRAF基因突变密切相关；可分为两型：CIMP-高（或CIMP1）：与BRAF基因突变相关，CIMP-低（或CIMP2），与KRAS基因突变相关，其病理学癌前病变的特征为绒毛腺瘤；细化分型的目的是为了深入探讨癌变机制。CIMP阳性CRC具有明确临床及病理特征：肿瘤好发于近端结肠，多见于中老年女性（最终的表型取决于是否伴发因基因启动子甲基化导致MLH1转录沉默所诱导的微卫星不稳定性）。CIMP阳性+非MSI-H表型CRC病理的浸润进展更严重，临床预后及转归较差；病理组织中缺乏肿瘤浸润淋巴细胞；CIMP路径的癌前病变主要是无蒂锯齿状腺瘤。典型的CIMP阳性+MSI-H CRC 与纯MSI-H CRC的特征相似，预后较好。腺瘤性息肉（从单纯腺瘤发展为进展期腺瘤，最终形成浸润性腺癌）是CIN路径CRC以及HNPCC的癌前病变。锯齿状息肉（也是很重要的一种息肉）是CIMP路径CRC的癌前病变 。

已经建立了家族性CRC综合征从实验室到临床（bench to bedside）的诊断方法，是大肠肿瘤转化医学研究的最前沿水平。家族性CRC综合征研究成果有助于深化对CRC的认识。

2 大肠癌分子生物学检测对临床诊疗的指导

大肠癌分子生物学检测对临床诊疗的指导包括以下几个方面：

（1）FAP是常染色体显性遗传综合征。APC基因胚系基因突变（APC是CIN路径中的重要基因）。特征是大肠腺瘤数目＞100个。如果没有手术干预，所有FAP病例均于50岁前发展为CRC。

（2）APC基因突变位点影响疾病的表型（无论是病变严重程度抑或相关的肠外特征都会受到影响）。APC基因中心区发生突变，大肠腺瘤数目较多，为典型FAP；

突变发生在基因两端的3（或5）时，导致一种较为温和的表型即所谓的衰减型FAP（AFAP），其特点是大肠腺瘤数目＜100个，CRC发生发展缓慢，比典型FAP延迟大约15年。

（3）MUTYH。MUTYH是一种DNA糖基化酶，帮助修复由于DNA氧化损伤导致的碱基错配防止基因突变（例如APC和KRAS），在CIN路径CRC发生发展过程中发挥关键作用。DNA修复缺陷是MAP的病因；MAP是一种常染色体隐性遗传疾病，导致多发性大肠腺瘤和癌症。MAP在表型上和AFAP相似。MUTYH双等位基因突变导致CRC风险增加93倍。

（4）MAP临床遗传学检测、筛查及咨询。应对下列对象进行APC和MUTYH基因胚系突变检测、筛查及临床遗传学咨询：大肠腺瘤＞20个（包括异时性病变）；发病年龄＜60岁、腺瘤数目＞/ = 5，本人或一、二级亲属中60岁前患CRC或高级别异型增生腺瘤者。检测程序通常会根据家族史而定。 已经确定的临床病理标准可用于判定HNPCC“高危”患者及亲属；“高危”者应接受进一步的分子生物学检测：MSI分析以及免疫组化法检测与HNPCC相关的四个MMR蛋白质，即MLH1、MSH2、MSH6和PMS2。如果MSI-H或肿瘤组织中选择性表达蛋白质缺失，则先证者需要接受胚系基因检测。HNPCC与 BRAF基因突变无关。BRAF检测具有新的意义：BRAF阳性可以确定为CIMP路径散发性CRC，从而排除HNPCC；临床上，MSI-H+BRAF阳性CRC有助于判定其源于CIMP路径MLH1基因甲基化，而不是HNPCC。

3 我们的研究工作

目前，我们已建立起以北京为中心，辐射北方地区的HNPCC协作组，共收集约200余个HNPCC家系。资料包括：患者肿瘤组织切片、患者及家系成员外周血样本、提取的DNA、RNA以及相关临床资料。建立了HNPCC MMR基因检测综合研究平台。包括免疫组化检测蛋白表达、微卫星不稳定性检测、突变检测、基因测序、大片段缺失和启动子甲基化检测等技术。利用该平台对106个中国北方地区HNPCC家系进行了系统研究，43个家系中发现了致病性突变。

在14个FAP家系先证者中发现9例微小突变，突变检出率为64.3%。包括6个移码突变，2个剪接区突变和1个无义突变。发现4个新的APC基因微小突变。在微小突变检测阴性的5例患者中，用MLPA的方法检测出2例存在大片段缺失，这两种大片段缺失均未见报道，大片段缺失的检出率为14.3%。微小突变与大片段缺失的总检出率为78.6%。

目前，EGFR受体导向治疗前常规进行KRAS基因检测。单克隆抗体西妥昔单抗（cetuximab）和帕尼单抗（Panitumumab）的靶点是表皮生长因子受体（EGFR） 和RAS-RAF-MEK-ERK路径，在治疗转移性CRC方面发挥重要作用。KRAS突变、野生型KRAS但BRAF或PIK3CA突变，对表皮生长因子受体导向治疗无反应。