癌症"细菌疗法"的研究进展

彭文岚 刘文娜 高静

（青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042）

目前的癌症治疗方法主要存在两个缺陷：不能有效地定位于目标肿瘤和不能有效地穿透肿瘤组织。定位性差限制了标准疗法的给药量，穿透性差使得进入肿瘤组织中的药量减少。这两个缺点导致目前的治疗方法不能根除所有的肿瘤细胞，从而导致癌症复发［1］。另外，在化学疗法两个疗程间隔的时间内，个别癌细胞会内渗进入血管组织而增加转移的风险。癌症复发和并发症是目前癌症病人死亡的主要原因。因此，要想完全治愈癌症就必须克服这两个缺点。细菌能够专一性地优先累积在肿瘤的低氧和坏死区域，经基因工程改造后可成为癌症治疗的有效工具。

有效的细菌疗法需要具有能准确定位于肿瘤组织，从遗传上入手，无毒性，瘤内定位和有效输送抗癌药物等特点［2］。在小鼠实验中发现有多种细菌如梭菌属（Clostridium），沙门氏菌属（Salmonella），双歧杆菌属（Bifidobacterium）和埃希杆菌属（Escherichia）［5］能特定的在肿瘤组织中积累。对于毒性和遗传可操作性，也已经做了大量的研究。目前的研究主要关注的是最后两项：有效的瘤内定位和药物输送。另外要做的研究还包括将细菌与治疗载体和抗癌物质相结合。一旦解决了这些问题，癌症"细菌疗法"将取得突破性的进展。

1 基因修饰和毒性

为了使细菌成为有效的抗癌载体，在过去的10年里进行了大量关于细菌毒性消除和基因修饰的研究。要使细菌满足治疗要求，必须对它进行基因修饰。在已研究过的三种细菌中，大肠杆菌是基因工程的模式生物，可以进行各种程度的基因修饰，沙门氏菌也具有同样的能力。但梭状芽胞杆菌属的使用有一些难度，因为利用传统的质粒载体转化和电转化方法很难使其发生改变，需要研究一种新技术以拓宽梭状芽胞杆菌属基因修饰的宽度［6］。

因为许多细菌本身就有致病性所以必须除去细菌毒性。1947年，有报道将溶组织梭菌（Clostridium histolyticus）的芽胞直接注入小鼠移植性肉瘤内，发现能使肿瘤液化消退，但由于梭菌本身的毒性以及由其介导的溶瘤作用能引起急性毒性反应甚至死亡，最后只有极少数动物存活下来［7］。后来通过热处理除去其致病基因获得一株诺维氏梭菌（Clostridium novyi）的无毒菌株，能广泛定植于肿瘤坏死区域而不损坏正常组织。缺失msbB-和purI-基因的鼠伤寒沙门氏菌突变体在临床试验中证明无毒性［8］，已经广泛用于癌症研究。也已证明大肠杆菌的减毒型突变体E.coli Nissle 1917无致病性，可用来治疗癌症。

2 瘤内定位

化学疗法存在的主要问题是不能渗透所有肿瘤微环境，且目前的疗法都不能精确的定位在那些存在药物抵抗力的肿瘤区域上，而细菌可以很好的解决这一问题。细菌瘤内定位的三种机理是特殊趋化性、优先生长和厌氧生长。兼性厌氧菌如沙门氏菌和埃希氏菌主要利用特殊趋化性和优先生长，专性厌氧菌如梭状芽胞杆菌和双岐杆菌属主要利用厌氧生长来实现其定位目的。这些机制使得细菌既可以定位于特定的肿瘤区域，又不会伤害正常组织。

正常组织和肿瘤组织的细胞微环境和血管结构有很大的不同。在肿瘤组织中由于血流量紊乱造成微环境异常，导致细胞生长速率和药物浓度梯度改变，出现厌氧和酸性区域［9］。肿瘤这种独特的细胞微环境有利于细菌生长，这是细菌具有特殊定位能力的主要原因。

药物浓度梯度的存在导致某些癌细胞中的药物水平不能达到有效清除浓度［10］。为了克服这种局限性，需要一种有效的药物输送方法。大多数治疗法依靠被动扩散来输送药物，这些方法的肿瘤特异性较高，但是因为扩散局限性而不能渗透到肿瘤组织内部。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是一种兼性厌氧菌，它可以受肿瘤中不同的微环境吸引，具有主动运输能力，从而克服扩散局限性渗透到肿瘤抗性区域，这种能力使得细菌成为一个吸引人的体系。就目前所知，具有运动能力的细菌是唯一能主动运输也是唯一能有效注入所有肿瘤组织的治疗载体。小鼠模型实验显示鼠伤寒沙门氏菌优先被肿瘤抗性区域中濒死的癌细胞吸引［11］。进一步研究发现，天冬氨酸受体控制细菌向肿瘤移动，丝氨酸受体引导细菌在肿瘤内部的渗透，核糖/半乳糖受体引导沙门氏菌进入坏死区域。剔除核糖/半乳糖受体基因能使鼠伤寒沙门氏菌在肿瘤抗性区域积累，引起癌细胞死亡。这些发现表明通过控制特殊化学受体的表达，沙门氏菌可定位于任何肿瘤区域。

兼性厌氧菌定位于肿瘤组织利用的另外一个机理是优先生长。在小鼠模型中，野生型鼠伤寒沙门氏菌优先在坏死组织中生长。通过改造细菌使其成为不能在无营养素的微环境中存活的营养缺陷型菌可以控制其定位作用。由静脉注入后，营养缺陷体向含有高浓度营养素的肿瘤区域移动并优先增殖，但它不能在正常组织中生长。如鼠伤寒沙门氏菌的亮氨酸/精氨酸突变体能特异的在小鼠前列腺肿瘤中积累［12，13］。

研究发现沙门氏菌也可定位于含氧量较高的肿瘤区域和转移灶。鼠伤寒沙门氏菌的好氧菌株在小鼠皮下肿瘤优先积累，积累量是在肝和脾中的2000倍。除趋化性和优先生长外，兼性厌氧菌在肿瘤抗性区域积累的原因还包括由巨噬细胞和嗜中性粒细胞引起的有限的免疫清除［15］。在早期肿瘤中，猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）可在肺部转移灶积累而不能在健康的周边主质组织中积累［16］。在常位肿瘤中，当用氯氨铂给药时，该菌株可以提高嗜中性粒细胞和T细胞的浸润作用，具有明显的抗肿瘤效果［17］。最近的研究显示，大肠杆菌也可以在肿瘤中积累［18］，且在肝和脾中的积累水平要比肿瘤中低得多。将E.coli K-12注射到小鼠体内后，会迅速引发抗癌免疫反应，从而大大减少肺部转移灶的产生。

最易理解的细菌肿瘤定位机制是厌氧生长。当将细菌芽孢由静脉注入后，专性厌氧菌选择性的在含氧量低的肿瘤区域增殖。作为抗癌媒介研究最多的专性厌氧菌是梭状芽胞杆菌。20世纪60年代多个研究证明梭状芽胞杆菌可在小鼠和人类肿瘤坏死区域积累。将梭状芽胞杆菌novyi NT芽孢与化学疗法和抗血管因子联合使用，可有效定位于小鼠的无血管、坏死的肿瘤区域，减少肿瘤复发。将梭状芽胞杆菌novyi NT与放射疗法联合使用，可提高治疗效果。梭状芽胞杆菌novyi NT的完整基因组序列显示其芽孢含有可翻译成氧化还原蛋白质和脂肪酶的mRNA，所以它可以在肿瘤中存活和增殖［19］。非致病性的Clostridium acetobutylicm芽孢经血管定位剂考布他汀A-4磷酸盐实验发现细菌在肿瘤中的生长有明显改善。

兼性和专性厌氧菌的定位机制是互补的。专性厌氧菌对肿瘤有选择性，因为低氧环境只在肿瘤中存在。这种高度专一性使得它们易于进入大型原发性肿瘤。相反，因为兼性厌氧菌依靠趋化性和优先生长定位于肿瘤，所以它们能够定位于转移灶和肿瘤坏死区域。这种不同的定位机制使得医生可以根据每个病人肿瘤的特点来决定治疗方法。

3 可控的给药途径

细菌能够合成和分泌蛋白质，从而辅助其定位功能提供特殊和集中性的治疗。利用蛋白质的不同功能，可以设计三种细菌治疗的方法：控制细胞毒性，酶类药物激活和活性分子分泌。利用细菌定位性，这三种方法可对给药时间和位置进行精密的控制，从而得到最佳治疗效果，并将系统毒性降低到最小。一旦细菌定位在肿瘤环境中，它们就可以被激活产生能直接或间接治疗疾病的化合物。

治疗因素尤其是细胞毒性化合物的时序控制是必须的，因为在输送至肿瘤的过程中基因表达的产物会扩散至全身，毒害健康组织。利用无毒因子如射线或小分子诱导的基因启动子来控制表达可以克服这个问题。射线照射可以有效启动基因表达，因为射线易于穿透人体组织进入肿瘤内部特定位点。放射疗法也是最常用的癌症治疗方法，这一方法已经经过体外实验证实。在辐射诱发的recA启动子序列时序控制下，梭状芽孢杆菌的某一经基因修饰的菌株Clostridium可表达TNFα。与未经射线照射的对照组相比，其TNFα的表达量提高了44％。该研究还发现在recA之下的基础基因表达很重要，会影响这种方法的可控性，通过向启动子序列中插入放射敏感性基因可以很好的解决这一问题。其他元素的添加能使基础产物的水平降低30％。而将这些启动子与其他不同基因相结合，会获得可控性更高的癌症治疗方法。

促进基因表达的另外一种方式是由小分子激活启动子。L-阿拉伯糖对哺乳动物细胞和组织无害，已用于激活大肠杆菌PBAD启动子。在细胞生长培养基中加入0.02％的L-阿拉伯糖，lux操纵子的表达量提高了105倍，但这一方法面临的问题是小分子可能因为扩散局限性而无法到达细菌菌落。然而，在以前的试验中并没有发现这个问题，将小分子由静脉注射15～30min后即可在肿瘤中检测到。

控制给药途径的第二个机理是对细菌进行基因改造使其产生酶类，将无毒的药物前体转化为活性因子。沙门氏菌和梭状芽孢杆菌已经被设计用来表达胞嘧啶脱氨酶（CDase），从而将前体药物中的5-氟胞嘧啶（5-FC）与化学疗法的5-氟尿嘧啶（5-FU）分开。CDase能催化5-FC脱氨基转变为5-FU，5-FU被代谢为5-FUTP和5-FdUTP，前者能整合入RNA代替UTP，从而抑制tRNA和mRNA的合成，后者则可抑制胸苷酸合成酶，导致DNA合成障碍，它可从RNA和DNA分子水平来干扰细胞的存活，并且该底物能通过细胞间的缝隙连接进行扩散，引起临近细胞死亡（即旁观者效应）［20］。在临床试验中，注射过该重组沙门氏菌的病人瘤内5-氟尿嘧啶的水平比血浆中提高了300％。梭状芽孢杆菌的某些种属经改造后可表达硝基还原酶，将CB1954（5-乙烯亚氨基-2，4-二硝基苯）转化为它的4-羟胺衍生物，而后者的毒性要比前者高10000倍。体外实验证明将药物前体与细菌治疗结合可促进肿瘤退化。这一研究还表明通过重复增量也可以获得肿瘤的连续退化。

细菌可以产生生理活性分子诱导生理反应，这是其药物输送的第三个机理。研究发现梭状芽胞杆菌经改造后可以产生治疗水平的白细胞介素-2［21］，从而引起T细胞介导的肿瘤死亡。低氧诱导因子-1α是一种转录因子，可以促进有利于细胞在低氧环境中生存的基因表达。目前已可用梭状芽胞杆菌表达抗低氧诱导因子-1α的抗体片段，当它与定位因子联合使用时，可以有效治疗癌症［22］。细菌也可用于输送DNA［23-24］，在这个过程中，基因从细菌传递到癌细胞然后表达哺乳动物的治疗蛋白。已设计出含有内皮他丁和凝血酶敏感素-1基因的沙门氏菌。这两个基因的产物通过抑制血管发生而阻碍肿瘤生长。在小鼠模型中，这两种治疗方法都能够大大降低肿瘤生长速度。

尽管实验证明细菌疗法具有很大的优越性，但是也存在许多的问题，比如在临床上这些细菌不能很好地定植人的肿瘤，外源基因在肿瘤内表达量不够或者非靶向表达等。这些问题都需要进一步的研究来解决。

4 总结与展望

癌症难治疗是因为脉管系统较弱而限制了它对氧、营养素和药物的输送。细菌疗法的优势是可以利用优先生长和能动的分子运输将药物分子定位于瘤内微环境。细菌抗癌研究的关键点是改造菌株，主要研究的两个方向则是瘤内定位和可控的给药途径。先前梭状芽胞杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的研究已证明某些细胞毒素、药物前体活化酶和生物活性分子的表达可以被控制。定位和输送系统的强度是互补的，当将两者结合时，可使药物到达所有的肿瘤和转移灶区域，并有效的杀死所有的癌细胞。将几种表达不同药物的细菌联合使用，有可能大大提高治疗的可控性和有效性。随着技术的进步，细菌疗法有望成为对抗人类肿瘤的强大工具，为癌症病人带来福音。

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