多酚氧化酶酶学特性研究及其应用进展

孔俊豪，孙庆磊，涂云飞，陈小强，高玉萍，杨秀芳

(中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州310016)

多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，以下简述为PPO)是核基因编码的铜金属酶，广泛存在于植物体的各类器官或组织中，如花器官、分生组织、叶片、块茎、根中，在伞菌目子实体内含量也较丰富。在正常状态下，细胞内多酚氧化酶与细胞器内膜结合，活性很低，但遭遇外界逆境时，PPO可以增加植物体对病原体的抗性［1］。然而当组织完整性破坏或膜受到伤害后，潜在的PPO大量被激活，质体内的多酚类物质在PPO作用下氧化成醌，植物组织的褐变随之发生。此外，在茶叶加工中，可依据不同的加工工序来协同调控PPO活性从而制成品质与滋味迥异的不同茶类［2］。

1 影响酶活的主导因素

1.1 来源

不同来源的PPO对于专一性底物的亲和力存在很大差别，部分原因在于同空间因子相关的酶蛋白质结构上的差异。吴进菊等［3］对多种植物和真菌中PPO的催化活性进行了比较，结果表明，茄子＞双孢蘑菇＞苹果＞梨＞山药＞马铃薯＞芋艿＞香蕉＞莴苣(比酶活)。同一植株内，不同成熟度、不同部位的PPO酶活性也有差异，一般在幼嫩部分酶活总量高于成熟部分。周春梅等的研究表明，白玉菇下柄的PPO酶活性最高，菌柄的PPO酶活性高于菌盖的PPO酶活性。姜红波等［4］对茶树菇不同部位的粗酶液活性测定表明，菌柄下酶活性最小;菌盖与菌褶处酶活性较大。与同类研究［5］得出的结论相似。

1.2 底物

PPO在不同的底物体系(一元酚和邻二酚)中，可以催化完全不同的氧化反应。底物不仅取决于植物组织、真菌子实体的种类，而且从同一种果蔬的不同品种分离得到的PPO也具有底物特异性。刘雅嘉等［6］研究了香菇PPO基于不同底物的Km值，其与三种底物间的亲和力强弱依次为L－多巴＞一水没食子酸＞邻苯二酚。

王丽霞等［7］以福云六号茶鲜叶为原料，以邻苯二酚为反应的底物，探讨了其中多酚氧化酶的特性，结果表明，在供试反应体系中，酶活性随底物量逐渐增长，但底物含量过高也会产生抑制作用。

1.3 作用温度

温度对于酶的催化活力具有重要的影响。PPO温敏性较强，多数情况下，在70～90℃下短时热处理已足以使它部分或全部地不可逆失活。

而PPO酶的热稳定性在一定程度上亦决定于其来源，存在于不同的质体、组织或同一的质体不同部位的PPO，其对热处理的耐受度有差异，宋金隆等［8］比较了茶树鲜叶、马铃薯、苹果中的PPO酶活性，表明不同来源，最适催化温度的不同，但温度变化对酶活力的影响趋势大体一致。经研究发现，茶叶PPO活性随着温度的变化呈现出先强后弱的趋势，高温对酶活的抑制作用更为明显［9］。低温效应度对酶活力的影响主要是降低PPO催化活力或使之处于可逆失活状态。夏涛等［10］研究了冷冻萎凋对茶叶PPO的影响，低温冻结状态下酶活变化不显著，但复温萎凋后活性下降达一半以上，温差造成细胞破裂致酶活损失。因此调节反应温度可以有效调控、提高PPO的催化活性。

1.4 pH 值

PPO作用的最适pH随酶的来源和选用的底物而变。多数情况下，果蔬中的 PPO最适 pH在4.2～7.0之间，不同的作用底物、提取缓冲液、分离方法对酶的最适pH也有影响，因此PPO的最适pH只在一定条件下才有意义［11］。在一些情况下，PPO具有两个最适pH，同工酶或多种分子形式是其可能原因之一。

李敏等［12］发现马铃薯PPO粗酶液活性随体系pH增加而增强，最适pH约在5.5处，同类研究［13］证实，杨梅果实中PPO活性随pH变化趋势与上述一致，受试范围体系pH接近中性时，PPO催化活性最强。不同真菌果实中PPO的活性变化均与pH之间存在一定相关性［14］。

1.5 储放条件

果蔬采后其PPO在相当长的时间内仍处于生理活性状态，对于植物质体的调节水平随储藏条件而变。朱凤妹等［15］研究发现，与新采马铃薯相比，贮藏一定时间后的马铃薯中总体PPO活性趋于下降。程建军等［16］对苹果梨中PPO活性在室温储藏过程中变化规律，苹果梨PPO活性先呈降低趋势，而后缓慢恢复，但活性变动幅度无统计显著性，室温保藏期间PPO活性高于低温保藏，呼吸强度大，刺激多酚类物质氧化聚合，破坏了PPO－多酚类物质之间的动态平衡，加速了果肉褐变。

2 酶活的辅调因素

2.1 激活剂和抑制剂

为防止酶促褐变，食品界在PPO的抑制剂方面开展了很多研究工作，而对于其激活剂相对了解较少。

阴离子洗涤剂如SDS(十二烷基硫酸铵)能激活PPO。SDS不仅可激活经PVP处理而失活的酶，而且也能够激活以潜在形式存在于粗提液中的PPO。适宜的添加浓度范围内，SDS对烟草PPO及嫩刺芽PPO均有一定的激活作用［17－18］。PPO的活性形式是含铜的酶单体的寡聚体，因此含Cu2+的化合物对源于小麦等的PPO也有激活效应［19］。

此外，金属离子能以不同的方式与底物、酶的活性产物和酶本身产生极强的亲和力，从而导致酶活性的改变。Ca2+和Na+能对酶活性产生抑制作用，Al3+、Fe3+、Cd2+、Co2+、Mn2+和 Zn2+则激发酶的催化功能［20］。

PPO的抑制剂依据其作用机制不同可分为酶基抑制剂和产物(或底物)抑制剂两类，第一类中具有产业应用价值的是抗坏血酸和柠檬酸，第二类中较有代表性的有二氧化硫、半胱氨酸、亚硫酸盐等。就茶叶PPO而言，NaHSO3对其抑制作用最显著，其次为L－半胱氨酸、抗坏血酸和EDTA，效果最差的为NaCl［7］，半胱氨酸对多种植物，如苹果、马铃薯、香蕉等体内的PPO都有抑制作用［21－23］。也有学者通过抑制剂复合协同进行抑褐保鲜，筛选得到了山药最佳感官风味的PPO抑制剂配方:0.05%柠檬酸+0.4%抗坏血酸 +0.02%EDTA［24］。

2.2超高压

超高压，又称液态高静压，以水和矿物油作为传递压力的介质，施加高静压(100～1 000 MPa)，并维持一定时间后可以改变食品的物化特性和化学反应速度，达到杀菌和改变酶活性的一种加工方法。和热协同处理可以减少果蔬中热敏物质的流失，低温热处理即可达到显著性钝化PPO的效果，但不同的压力可对PPO的活性产生抑制或激活作用［25－26］。

2.3 微波辐照

微波灭酶处理具有热特性和非热特性。辐照对茶叶中PPO活性的抑制程度受剂量影响，低于或高于最佳剂量均不能达到理想的效果［27］，辐照处理协同理化因子调控可提高对酶活力的抑制程度，研究表明3kGy辐照剂量与适宜pH复合处理能够抑制梨汁中92%的PPO活性［28］。微波作用改变酶液中的键合作用，从而改变蛋白质的构象［29］，体系在生物效应和热效应的双重作用下，PPO活性被迅速钝化。

2.4 脉冲电场

脉冲场通过电场强度的变化改变PPO的二级结构，影响其构象从而使酶灭活［30］，而且酶的残余活性随着磁场强度和脉冲数的增加而逐渐降低，最高灭活率可达90%以上［31］。

2.5 振动

振动胁迫在一定程度上也对PPO有抑制作用。肖丽娟等［32］研究发现水蜜桃果实在贮藏过程中，振动处理组PPO活性始终高于对照组，并且振动时间越长PPO活性越高。茶叶初制加工过程中，经振动处理的茶鲜叶PPO活性会迅速降低，振动强度越大，下降越快［33］。

3 应用研究进展

PPO对于果蔬保鲜和采后加工具有重要意义，为避免褐变造成的食品品质下降，加工过程中PPO酶的钝化处理一直是研究的热点，而在不同茶类加工过程中合理调控茶叶PPO活性对于茶叶品质的提升。

3.1 果蔬保鲜褐变控制中的应用

PPO抑制在防止水果和蔬菜褐变方面起着重要的作用。抑制PPO活性或消除酶促反应的发生条件能较好地保持鲜果的色泽、风味及营养。酶促褐变的发生需要三个条件:底物(多酚类物质)、氧介质、PPO［34］。实际操作中从食品中除去PPO的底物(多酚类物质)不仅困难，而且不现实。因此比较有效的是抑制PPO活性，其次是防止与氧接触。

3.1.1 温度调控

冰温保藏，是将食品贮藏在0℃以下至各自的冻结点的范围内的保鲜方式，继冷藏和气调之后，成为第三代保鲜技术。冰温可以抑制PPO酶活，减少总酚含量的下降趋势，对果蔬的保鲜有着明显的作用。冰温贮藏作为一种新型的物理保鲜方法，研究表明［35］其对莲藕保质期比冷藏要长，并且冰温贮藏后的果实以低温冷链方式出库后其PPO在货架期内始终处于较低水平［36］，对于延长鲜食果蔬的货架寿命收效显著。

瞬时高温可使包括PPO在内的酶钝化，热处理是生产中常用钝酶方法之一，通常以PPO作为热烫指示剂，常以蒸汽或热水为湿媒介，通过热烫或漂烫工艺用于压榨果汁的预处理［37］，提高产品中功能成分含量，改善速冻食品的感官品质和风味，不过在工业中漂烫的最佳终点判断至关重要。不同的果蔬品种，具体处理参数不同，适度的处理时间内亦可提高出汁率，时间过长则会导致营养成分流失［38］。

3.1.2 酸度调控

大多PPO最适pH值在6.0～7.4范围，在pH值降至4.0以下，PPO几乎完全失去活性。因此利用调酸降低pH值的方法抑制果蔬褐变，是果蔬加工中常用的方法。可采用加入适量的pH调节剂如柠檬酸、苹果酸、醋酸等降低pH值，抑制褐变发生率，多为两种或两种以上复合使用，且符合食用级标准。乔勇进等［39］研究表明pH对贮藏梨汁褐变影响较大，随着pH降低，梨汁褐变度越大。

3.1.3 抑制剂调控

Vc、NaHSO3、L－Cys、EDTA 对各种来源的 PPO的活性都有抑制作用。Vc不仅可降低环境pH值，它与异Vc钠既能抑制PPO本身的催化作用，同时又能还PPO形成的产物醌为酚，并且还能消耗反应体系中的氧而L－Cys既能与醌形成无色的聚合物，又是醌的还原剂，还原醌为酚［40］。另外EDTA可与酶分子中Cu2+络合抑制酶活性，甚至饱和NaCl也能显著抑制酶活性［1，7］。因此适量加入这些抑制剂来抑制PPO活性是控制酶促褐变的有效途径之一。在实际生产中较为理想的抑制剂是Vc，这是由于Vc是水果中的成分，安全性高，因此在工业生产中可以广泛地应用。

3.2 茶叶加工中的应用

3.2.1 绿茶杀青

绿茶加工过程中，关键工序是杀青，通过高温(100～300℃)使鲜叶中的酶迅速变性失活，及时终止鲜叶中包括PPO在内的各类酶促反应，使成品茶保留较多的叶绿素、多酚类、维生素C等热敏性品质成分，从而形成绿茶“清汤绿叶”的品质。传统的杀青方法包括蒸气杀青、锅炒杀青，近年来有微波杀青、远红外辅助杀青、超高压等新技术用于绿茶杀青处理过程［41－43］，对于酶质的活性进行柔性钝化，更有利于茶叶理化成分的保留和优良品质的形成。

3.2.2 红茶发酵

红茶属酶性氧化茶类，须满足多酚类酶性氧化聚合反应所需要的最适温度、湿度和氧气条件。经萎凋、揉切后，茶叶中PPO酶类活性得到激活，PPO与多酚类及空气充分接触，使多酚类中的没食子儿茶素及其没食子酸酯先行氧化为邻醌，再逐步氧化缩合，成为茶黄素和茶红素，使红茶具有汤色叶底红亮、香味浓郁等独特品质。

日本静冈茶试站早在20世纪90年代即通过在红茶发酵过程中添加外源微生物PPO以提高茶黄素的合成量，以此改善红茶品质［44］。近年来国内也有将外源引入液态发酵协同茶叶自源PPO进行茶制品生产，实现过程的动态调控，以提高产品品质和制率［45］。

此外半发酵茶如乌龙茶的萎凋、摇青工序及白茶的萎凋等均属利用茶青中PPO酶的活性进行初制加工形成特征各异的茶类成品。采用差异化工艺条件的控制，利用或抑制茶叶PPO的活性从而借助不同的氧化伴生反应形成品质独特的茶类产品开发已成为当前茶叶加工的一大研究热点。

4 应用研究展望

多酚氧化酶是生物质体的自源代谢酶类，不仅在生物体的生长期维持自体次生代谢的平衡，也与果蔬采后生理和再加工产品品质有着紧密的联系。控制果蔬汁在加工、储藏过程中的酶促褐变，保留、改善农副产品的营养成分和感官品质符合消费者对健康产品的食用价值需求。

当前，人们已经从物料自身酶的活性和酶促反应的辅助因子、外界环境等的控制等多方面入手，找到了多种控制果蔬汁中酶促褐变的有效方法。但是因为不同果蔬物料中的PPO具有特异性，根据果蔬品种的不同，单一的方法存在一定的局限性。随着非热加工技术的发展，超高压、辐照、脉冲场、冰温贮藏等在酶作用机制方面的广泛研究和协同化应用，为果蔬加工过程控制褐变提供了相对广阔的工业化技术和理想方法。

同样，PPO作为茶叶产品加工过程中的重要品质决定因素，随着市场差异化产品的需求，应用新型加工技术及酶工程技术，针对性地创设PPO活性调控的理化条件，充分发挥PPO的生理催化优点，进而专一性改善茶叶产品中某一类成分的含量，提高茶制品的风味和质量，将会是未来新型茶制品开发的一大研究亮点，有着广阔的应用前景。

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