棘球蚴病与棘球绦虫病诊断与检疫方法研究进展

聂华明，余 华，严玉宝，杨光友，古小彬

（1.四川农业大学动物医学院，四川雅安 625014;2.四川出入境检验检疫局，四川成都 610041）

棘球蚴病（Echinococcusis）是带科（Taeniidae）棘球属（Echinococcus）绦虫的中绦期幼虫（棘球蚴）寄生于动物和人的肝脏、肺及其它器官而引起的人兽共患寄生虫病，其成虫寄生于犬、狐和狼等犬科动物的小肠引起动物棘球绦虫病并成为人和动物棘球蚴病的主要疫源[1]。

本病呈世界性分布，主要流行于欧洲、非洲北部、亚洲、南美洲和大洋洲，在我国主要见于新疆、宁夏、青海、西藏、甘肃、四川阿坝和甘孜、云南迪庆、陕西北部和内蒙古西部等地[2]。目前全世界报道棘球属绦虫有6种，在我国分布有3种，即细粒棘球绦虫（E.granulosus）、多房棘球绦虫（E.multilocularis）和石渠棘球绦虫（E. shiquicus）[1]。其中，严重危害人和动物具有公共卫生及检疫意义的虫种为：细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫[3]。

对棘球蚴病及棘球绦虫病的诊断与检疫是防控本病的重要技术措施之一。目前报道棘球蚴病的诊断与检疫方法有：以棘球蚴囊液抗原、原头节抗原、分泌抗原以及重组抗原为基础建立的免疫学诊断，以及X射线、超声波、CT扫描和核磁共振等影象学方法；而动物棘球绦虫病的诊断与检疫方法有：虫体检查法、粪抗原检测法和粪源PCR法[1，4]。通常可采用联合多种方法从而提高诊断与检疫方法的敏感性和特异性。本文论述了各种方法的应用及其优缺点。

1 棘球蚴病的诊断及检疫

1.1 免疫学方法

免疫学方法诊断棘球蚴病具有快速、敏感、特异、价廉等优点，被广泛应用于该病的诊断及检疫中，辅以影象学诊断，可达到早期诊断的目的。天然抗原诊断具有高敏感性，但特异性不强。纯化抗原的特异性较高，但敏感性却有所降低[5]。

免疫学诊断在敏感性和特异性上存在缺陷，其运用也受一定的限制。有人提出用ELISA结合免疫印迹技术或arc5测试（用包囊液抗原和棘球蚴病患者血清进行免疫电泳试验，产生了一条沉淀线，将其称为弧5）是提高诊断敏感性的最佳方式之一[4]。

1.1.1 皮内试验（IDT）

皮内试验（IDT）诊断包虫病操作简单，敏感性高且易于现场应用但此技术抗原标准化难度较大、特异性较差。假阳性多见于癌症、结核、肾病和蠕虫病（尤其是各种绦虫病），且IDT可使部分患者发生过敏反应[6-7]。

1.1.2 间接血凝试验（IHA）

间接血凝试验（ IHA）诊断棘球蚴病其敏感性和特异性较为理想。该技术是以戊二醛醛化红细胞，再经鞣酸鞣化，用棘球蚴囊液抗原（SHF）致敏红细胞后作IHA检测，具有简便、快速、敏感性高等优点[8]。

间接血凝试验的改进措施主要包括：制备冻干的致敏红细胞和热稳定蛋白抗原，使其与新鲜血球具有相同的敏感性和特异性。制备包虫IHAT冻干抗原和包虫囊壁冰冻切片抗原，该抗原在-20℃可分别保存两年和3个月。

1.1.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA方法是用已知抗原或抗体，定性或定量测定特异性抗体（间接法）或抗原（夹心法），据显色反应的速率和强度判定结果。其优点在于简便易行，不需要昂贵的仪器，敏感性高。

ELISA测定总IgG及各种抗体亚基可提高诊断特异性。有人用ELISA测定人IgG、IgG2、IgG3和IgG4对EgTPx（细粒棘球蚴原头节抗原）的免疫反应，101例确诊的细粒棘球蚴病人中发现总IgG阳性为83例（83%），IgG4阳性为14例（14%），IgG2和IgG3均为阴性[9]。

因包囊寄生部位不同，ELISA方法的敏感性在36%～90%之间波动，特异性在65%～96%之间波动；该法检测肝包虫病，其敏感性高于肺包虫病[2]。包囊大小不同其敏感性也有所变化，阳性预测值（PPV）在寄生包囊>15cm时其敏感性为69.7%，包囊<15cm时为78.7%[10]。

因检测样品来源不同，其检测结果也有明显的差异。有人采集包虫病人血清、唾液、尿液作ELISA检测，结果显示：血清、唾液、尿液的敏感性分别是72%，56%和84%，所有样品的特异性都为76%，且尿检与唾液检测有显著性差异[11]。

1.1.3.1 斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA）

应用该方法在棘球蚴病诊断中，以硝酸纤维素膜代替聚丙乙烯板作为反应载体，通过加样抽滤使抗原均匀牢固地吸附于硝酸纤维膜上，简化包被抗原过程，缩短酶标二抗与抗体抗原结合物反应的时间。也可用白色聚乙烯（PVC）或聚偏二弗乙烯（PVDF）代替硝酸纤维膜，减少血清稀释误差，且洗涤方便、快速[12-13]。

1.1.3.2 间接酶联免疫吸附试验

间接ELISA技术利用酶标记的抗抗体与已与棘球蚴抗原结合的抗体具有很强的诊断价值。贾红等利用纯化的EG95重组蛋白建立间接ELISA，检测采自新疆的70份羊包虫阳性血清和70份阴性血清进行检测。结果表明该方法与新西兰wallaceville动物研究中心提供的间接ELISA方法符合率为100%，阻断试验结果显示与其他蛋白无交叉反应，批内变异系数介于3.8%～5.6%，批间变异系数介于5.7%～8.5%，结果表明该方法特异性强、敏感性高、重复性好[14]。

1.1.3.3 金黄色葡萄球菌A蛋白酶联免疫吸附试验（SPA-ELISA）

金黄色葡萄球菌A蛋白酶联免疫吸附试验（SPAELISA）以过氧化物酶标记SPA取代酶标第二抗体。并升高孵育温度（41℃），缩短时间，以快速SPAELISA用以检测101例包虫病人血清，验证阳性率为85.15%，特异性为 100%[15]。

1.1.3.4 亲和素-生物素-酶复合物酶联免疫吸附试验（ABC-ELISA）

ABC- ELISA是利用亲和素对生物的高度亲和力，导入生物素的酶分子紧密结合，产生多级放大作用，提高诊断敏感性。该法比普通ELISA敏感性高出3～80倍，显色更为清晰且能减少假阳性率。有人将ABC-ELISA和常规ELISA法进行了比较，证实ABC-ELISA法对那些抗体水平较低的包虫病人更具有诊断价值[15]。

1.1.4 酶联免疫电转印迹法（EITB）

免疫印迹技术诊断棘球蚴病具有非常理想的诊断敏感性和特异性。包囊囊液抗原19，21和63 kDa亚基可用于免疫印迹诊断羊包虫病，其敏感性为97.6%，特异性在100%。而8 kDa亚基作免疫印迹诊断，其敏感性可高达97.6%，且适合于早期诊断[16]。

经SDS–PAGE 分析，囊液抗原的特异性蛋白分子大小分别为29，45，58，68，98和116 kDa，免疫印记结果显示116 kDa的囊液抗原为较佳的特异性诊断抗原，其特异性和敏感性分别为88%和84%，其交叉反应仅发生于几种棘球属绦虫和囊虫之间[17]。

1.1.5 免疫胶体金技术

胶体金作为标记物具有操作简单，省事，无毒，无致癌性物质，无需昂贵仪器等特点。固相金斑免疫试验（DIGFA）以微孔滤膜为固相载体，抗原抗体在膜上结合，渗滤浓缩促进反应，再以胶体金作为指示剂直观显色。郭志宏等利用快速诊断试剂盒对青海包虫病人进行血清学诊断获得良好效果[18]。冯晓辉等利用粗提的囊液抗原EgCF，纯化的囊液抗原AgB，原头蚴抗原EgP以及体壁抗原Em2都可作为诊断抗原建立固相金斑试剂盒，具有良好的特异性和敏感性[19]。

1.2 影像学诊断与检疫

1.2.1 X射线

X放射仪很早就应用于棘球蚴病的诊断上，通过胸透诊断肺和肝的病变时能够看到椭圆而边缘界限清晰、质地均匀的完整包囊。

腹部X射线检查时能够检查出肝包虫钙化情况，钙化现象往往出现在外囊并且呈现典型的弧形，而内囊出现钙化现象则显示出斑影。X射线检查肺棘球蚴病时，如果囊壁破裂则会出现以下现象：新月症，双弓现象与水上浮莲现象[20]。

有人采用便携式的X射线仪进行大规模流行病学调查，发现有5.5%的人患有包虫病其中肺脏包虫病的概率为1.1%。对于多房棘球蚴病的诊断很缺乏敏感性，因为在感染早期是很不容易发现[21]。

1.2.2 B超

B超与其他诊断发法相比具有无侵袭性、便宜的优点，它能区分囊肿与实质包块，并能提示囊内膜的存在。在临床诊断及流行病学调查中具有较高的应用价值[22]。世界卫生组织（WHO）公布了各类包虫病的超声学分类标准，通过与该标准的对比可得出该类棘球蚴病的确诊结果。有人提出应用7.5兆赫的探头，不但可加强囊壁的声像显示，而且使包囊之间、钙化区、子囊和囊壁厚度等显示更为清晰[23]。但超生诊断检测羊肝棘球蚴病时敏感性较低，而羊肺棘球蚴病完全不能检测[24]。

1.3 CT

1.2.3 CT技术密度分辨率高，断面清晰，病变细节显示良好，尤其克服了X平片等显示不了的细小钙化、液化等结构，对定性诊断很有帮助。

在CT检查肺小叶动脉内包囊时利用影象对比度而加强囊壁显影，可对包囊精准定位。在CT下囊壁的显影加倍，血栓却无变化，故包囊与血栓区分明显[25]。

1.2.4 磁共振技术（MRI）

核共振技术（MRI）开始应用于泡状包虫病的诊断，特别适用于没有发生钙化的棘球蚴病诊断。该技术能检测出包虫寄生部位邻近组织的详细情况，为器官大面积切除和移植提供参考[26]。

2 棘球绦虫病的诊断与检疫

2.1 沉淀及计数法（SCT）

在犬科动物棘球绦虫病诊断中，沉淀和计数法（SCT）一直被认为是最精准的检测手段。该技术要求剖开犬类动物肠道，灌入生理盐水进行孵育，刮取肠粘膜，收集肠道中的蠕虫，在双目显微镜下观察肠粘膜沉淀并进行虫体计数。该诊断手段敏感性高，但须以严格的防护措施为保障[27]。

2.2 槟榔碱诱泻法

槟榔碱诱泻法运用于活体犬科动物棘球绦虫病的诊断与检疫。将犬科动物灌服氢溴酸槟榔碱，30min～60min后通过检测其排泻物中的虫体而进行棘球绦虫病的诊断。该技术在评估粪抗原和粪源DNA检测试验中具有重要参考价值，其特异性高达100%且可用于定量研究。

然而，催泻法在现场检测中具有高危性且氢溴酸槟榔碱对犬科动物具有强烈的副作用。此外，该技术敏感性较低，运用于诊断细粒棘球绦虫病时为38%，诊断多房棘球绦虫病时为21%[27-28]。

2.3 粪抗原ELISA（Copro-ELISA）

带科绦虫（Taenia spp.）成虫寄生于犬科动物的肠道，仅通过粪样检查从虫卵形态学上对棘球绦虫病进行诊断与检疫十分困难。粪抗原ELISA（Copro-ELISA）用特定的抗体进行包被，能够敏感地检测出棘球绦虫成虫体壁抗原以及其分泌物抗原的存在。有学者运用粪抗原ELISA（Copro-ELISA）诊断细粒棘球绦虫其特异性高达96%，通过氢溴酸槟榔碱诱泻法验证其敏感性在77%～88%之间。同时，该学者将粪抗原ELISA法与其它方法进行了比较分析显示：粪抗原ELISA（Copro-ELISA）诊断棘球绦虫病其总体敏感性和特异性都高于沉淀及计数法（SCT）和槟榔碱倾泻法[29-30]。

粪抗原ELISA（Copro-ELISA）在早期诊断野生犬科动物自然感染棘球绦虫病中也具有很高的应用价值。该技术可诊断出处于潜伏期的棘球绦虫，且ELISA诊断效果与寄生虫量有关。当寄生的成虫体数量＞100时其敏感性好，而虫体数量较少时其敏感性也随之降低[27]。

为提高诊断敏感性，将细粒棘球蚴原头蚴分泌抗原免疫兔获得兔抗原头蚴IgG，将其纯化后偶联上生物素酶类可检测犬科动物粪中的分泌性抗原[31-32]。此外，在提高粪粪抗原ELISA（Copro-ELISA）诊断特异性方面，也有多项技术出现。利用杂交瘤细胞接种SCID小鼠制备EmA9单克隆抗体，用于Sandwich-ELISA可诊断红狐感染多房棘球绦虫病。也有人制备了两种鼠抗细粒棘球绦虫原头蚴分泌抗原单克隆抗体（E.granulousus E/S IgM MAbs）分别命名为 EgC1和EgC2。将两种单克隆抗体应用于犬科动物细粒棘球绦虫病诊断，结果显示该单克隆抗体在攻虫后35天和试验结束的55天都能发生良好反应，且未出现假阳性[33]。

该技术能同时应用于尸体和活体检疫，从而可全面诊断与检疫棘球绦虫病，但由于与其他蠕虫抗原有交叉反应，诊断结果与预期可能存在较大差异。

2.4 粪源PCR（Copro-DNA Test）

随着分子生物学研究的深入，具有高特异性的PCR技术已经运用于诊断和检测犬科动物粪便和粪便中分离出来的虫卵。通过对样品中分离出来的虫卵进行PCR诊断，对细粒棘球绦虫病的诊断敏感性达到78%，多房棘球绦虫病的诊断敏感性为50%。该技术不仅能区分几种形态学上相似的几种带科绦虫虫卵，而且能确定虫卵量[34]。

2.4.1 粪样中抽取DNA

粪源DNA诊断技术需要获得足量且单一的样品。用酚、氯仿等有机溶剂对粪样进行反复抽提，离心上柱，尽量除去样品中的蛋白质。也可通过将粪样连续筛虑；或通过氯化锌漂浮步骤，利用毛细管的虹吸原理获得高纯度蠕虫虫卵，减少PCR抑制物对扩增反应的干扰。然而在红狐与犬粪PCR反映的抑制效应很少得到关注，故要求增加一个额外的孵化步骤以及一个洗脱DNA吸附的步骤[35-36]。

2.4.2 PCR

尽管从粪样中分离蠕虫虫卵的方法已经得到很大的改进，很大程度上除去了PCR扩增抑制物，但PCR扩增之前应有再纯化步骤。依靠设立对照扩增样品，并且对于平行的每个扩增产物都掺加示踪物，减少交叉污染。在PCR扩增缓冲液中加入牛血清蛋白（BSA）可提高扩增效率[35]。

2.4.3 多房棘球绦虫（E. Multilocularis）

现今，U1 snRNA基因和线粒体12S基因应用于犬科动物肠道多房棘球绦虫病的PCR诊断，但U1 snRNA基因特异性引物还能扩增出细粒棘球绦虫（E.granulosus）马株序列。通过巢式PCR扩增线粒体12SrRNA部分基因能特异地把多房棘球绦虫（E.multilocularis）从细粒棘球绦虫（E.granulousus）、狐 绦 虫（Taenia ceassiceps）、泡 状 带 绦 虫（Taenia hydatigena），马堤绦虫（Taenia martis）、鼠绦虫（Taenia mustela）、羊带绦虫（Taenia ovis）、豆状带绦虫（Taenia pisiformis）、多刺绦虫（Taenia polyacantha）、锯齿带绦虫（Taenia serialis）、巨颈带绦虫（Taenia taeniaformis）、中殖孔绦虫（Mesocestoides leptothylacus）以及几种从狐狸上分离出来的带科绦虫鉴别开来。将其应用于250只野生狐狸的绦虫病粪源DNA诊断，通过肠内容物刮取术（ICS）验证，其特异性为100%[37]。

2.4.4 细粒棘球绦虫（E. Granulosus）

粪样PCR诊断细粒棘球绦虫病具有重要作用。据报该法检测目标重复序列（EgG1HaeIII），整个基因为269 bp，目标片段为133 bp敏感性高，一枚虫卵即可检测。其电泳条带亮度随虫卵数增加而增加，但该片段是带科绦虫中存在的高度保守序列，特异性较差[38-39]。

依据细粒棘球绦虫线粒体基因COI设计出了一对通用引物对兼并引物：上游引物：5'-GTAAATAA MACTATAAAAGAAAYMC-3'，下游引物 ：5'-TCATA TTGTTTGAGKATYAGTKC-3'。应用于细粒棘球绦虫6种虫株和少节棘球绦虫（E.oligarthrus）以及福氏棘球绦虫（E.vogelia）的鉴别诊断。但该技术还没有在粪便和环境材料诊断及检疫上得到有效确认[40]。

在犬科动物棘球绦虫病诊断中，粪源PCR技术耗材耗时，一般不作为常规诊断与检疫手段。绦虫卵不规则脱落，故定量PCR技术也仅局限于检测一些来自少数动物的单个粪样。进行粪源PCR诊断时抽取DNA量与虫体肠道寄生的阶段（一般指从感染原头蚴后到排孕卵节片之前）有关，所以该技术作早期诊断效果不佳。

2.5 棘球绦虫病的血清学诊断

用ELISA对犬肠道寄生的细粒棘球绦虫和狐狸肠道寄生的多房棘球绦虫诊断表明：诊断敏感性和特异性以及早期感染缺乏有效的特异性抗体都是本技术运用的障碍[41]。犬既是棘球绦虫的中间宿主，也是其终末宿主，血清学诊断联合粪抗原诊断或粪源DNA检测能够准确地反应犬棘球绦虫病感染情况[42]。

3 结语

建立系统高效的诊断与检疫手段对防控棘球蚴病与棘球绦虫病具有重要意义。诊断与检疫方法研究与疫苗研发相互促进，将推动包虫病防治工程的发展。

棘球蚴病与棘球绦虫病的诊断与检疫方法存在的问题在于：缺少具有标准意义的诊断方法及抗原制备法。目前，动物棘球蚴病与棘球绦虫病的诊断与检疫最终可通过尸体剖解法进行确诊，而人棘球蚴病以免疫学诊断方法辅以影像学检查可达到较为理想的诊断效果。

今后尚需解决的问题是：寻找更多具有较高免疫学诊断价值的天然抗原与重组抗原；通过改变反应载体或者反应放大技术提高诊断与检疫效率；棘球蚴线粒体基因筛选以促进棘球绦虫粪源分子生物学诊断的发展。

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