苯磺酸氨氯地平分散片人体生物等效性试验研究

连柏杨 谢秋红

苯磺酸氨氯地平(amlodipine besylate)是二氢吡啶类长效钙离子拮抗剂，通过选择性抑制血管平滑肌内钙离子通道的内流，松弛血管平滑肌，降低外周血管阻力，从而达到降低血压的目的[1]。在临床上，主要用于治疗高血压，心绞痛，尤其是自发性心绞痛[2]。本试验用HPLC-MS法测定苯磺酸氨氯地平在血浆中的血药浓度，选择同类制剂氨氯地平片剂作对照，并评价两种制剂的人体生物等效性，为临床应用提供依据。

1 方法学考察与评价

1.1 标准曲线的制备取空白血浆1000 μl，分别加入苯磺酸氨氯地平标准溶液100 μl，制成相当于苯磺酸氨氯地平血浆浓度为0.15、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 ng/ml的系列标准血浆样品，按“血浆样品预处理”项下方法操作，每一浓度进行双样本分析，并记录色谱峰面积和图谱。

由测得的苯磺酸氨氯地平峰面积内标物尼莫地平峰面积的比值R对血浆药物浓度C进行线性回归分析[3]，用加权(w=1/χ2)最小二乘法[4]求得标准曲线回归方程:R=0.2eC-2.8×10-2，r=0.9982。其线性检测范围:0.15～16.0 ng/ml，定量下限为0.15 ng/ml(S/N≥3)。

1.2 专属性氨氯地平和尼莫地平(内标物)离子化源为ESI源;检测方式:正离子检测;扫描方式:多反应离子监测(MRM)方式，定量分析时的离子反应分别为m/z 409→m/z 238(氨氯地平)和m/z 419→m/z 343(内标尼莫地平)，其二级全扫描图和结构见附图1。

分别取6名健康受试者的空白血浆1000 μl，除不加内标外，按“血浆样品处理”项下方法操作(以甲醇代替内标溶液)，进样5 μl，记录色谱图;将一定浓度的苯磺酸氨氯地平标准溶液和内标溶液加入空白血浆中，依同法操作，得色谱图。氨氯地平的保留时间为0.75 min，内标尼莫地平的保留时间为1.38 min;取健康受试者给药后收集的血浆样品，依同法操作，记录色谱图。结果表明，空白血浆中的内源性物质和代谢物不干扰血浆中苯磺酸氨氯地平和尼莫地平(内标物)的测定。

1.3 萃取回收率、精密度在空白血浆中精密加入苯磺酸氨氯地平系列标准溶液，制成0.5、2.0、12.0 ng/ml的3个标准系列血浆样品，每一浓度进行6样本分析。同时，另取空白血浆1000 μl，不加苯磺酸氨氯地平系列标准溶液和内标溶液，其他按“血浆样品预处理”项下的方法操作，取5 ml进样分析。获得相应的峰面积(三次测定的平均值)，以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率[5]。

在空白血浆中精密加入苯磺酸氨氯地平系列标准溶液，制成0.5、2.0、12.0 ng/ml 3个标准系列血浆样品，每一浓度进行6样本分析，连续测定3 d，计算日内、日间精密度，结果均在要求范围内。

1.4 稳定性试验在空白血浆中精密加入苯磺酸氨氯地平系列标准溶液，制成0.5、2.0、12.0 ng/ml 3个标准系列血浆样品(每浓度3样本分析)，分别进行室温下放置8 h、-20℃保存30 d、3个冷冻-解冻循环后稳定性试验。结果显示苯磺酸氨氯地平高、中、低3个浓度血浆样品，在室温下放置8 h内稳定，RSD＜10%;-20℃保存的苯磺酸氨氯地平血浆样品在30 d内稳定，RSD＜15%;苯磺酸氨氯地平血浆样品经过3个冷冻-解冻循环后稳定，RSD＜10%。

1.5 数据处理用DAS2.0软件处理20名受试者各取血点的HPLC-MS测定结果，其中Cmax和Tmax取实测值，AUC用梯形面积法计算。对Cmax、AUC、AUC的对数转换值及Tmax的实测值进行方差分析和双单侧t检验及90%可信限判断，以AUC:80%～125%和Cmax:70%～143%为判定标准[5]，考察两制剂是否具有生物等效性。根据两制剂中苯磺酸氨氯地平的AUC0-144计算相对生物利用度。

2 结果

2.1 血药浓度-时间曲线20名健康受试者单次口服苯磺酸氨氯地平试验制剂和参比制剂10 mg后的血浆中氨氯地平浓度范围为0.16～8.6 ng/ml，在本试验的线性范围内。

2.2 生物等效性苯磺酸氨氯地平分散片试验制剂的相对生物利用度为(97.6±14.8)%。两制剂主要药动学参数经配对t检验，结果表明，两种制剂的药动学参数差异均无统计学意义(P＞0.05)。AUC0-t，Cmax经对数转换后进行药物间、周期间、个体间的3因素方差分析，双单侧t检验均无显著性差异。lnAUC0-t，ln Cmax的(1-2α)90%置信区间为90.8%～102.6%和81.9%～98.3%。结果表明，两制剂具有生物等效性。

3 讨论

液相色谱-质谱联用技术(LC/MS/MS)是一种将质谱仪作为检测器的色谱技术，它将HPLC的高分离能力和MS的高灵敏度、高选择性有机结合起来，具有样品处理简单、快速，方法的专属性及选择性均较高等特点。因此，它成为药物代谢与药物动力学研究中强有力的工具，而广泛应用于药物的开发及临床应用研究。本试验结果表明，应用LC/MS/MS法测得的苯磺酸氨氯地平在健康人体内的药动学参数与已有研究报道基本一致[6，7]。本试验方法学验证结果显示，苯磺酸氨氯地平血药浓度测定的标准曲线的线性范围为0.15～16.0 ng/ml(r2=0.9982)，苯磺酸氨氯地平血药浓度测定的最低检测限度为0.15 ng/ml，日内、日间变异系数以及提取回收率亦均符合生物样品分析要求，证实了本试验方法的可靠性与准确性。

[1]许俏红，杨政.洛活喜的动力学与临床应用.海峡药学，1997，9(3):110-111.

[2]王江红.苯磺酸氨氯地平片研究新进展.中国药业，1998，7(10):39.

[3]SFDA.药品临床试验管理规范，2003.

[4]钟大放.以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题.药物分析杂志，1996，16(5):343-346.

[5]中华人民共和国药典2005年版附录ⅩⅨB药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则.化学工业出版社，2005.

[6]张孝清，陆宏国，徐玉凤，等.苯磺酸氨氯地平片相对生物利用度研究.中国新药杂志，2003，12(10):849-851.

[7]栾燕，张逸凡，陈笑艳，等.氨氯地平在中国受试者体内的药物动力学及制剂的生物等效性.沈阳药科大学学报，2000，17(5):327-380.