maFGF对衰老大鼠脑组织SOD、MDA和羟自由基及神经细胞凋亡的影响

黄俊杰， 王彩冰， 黄丽娟， 何显教， 黄彦峰， 赵善民， 李倩茗， 李佳荃

2009年底，我国60岁以上的老年人口已经达到1.67亿，占全国总人口的12.5%，中国已经步入老龄社会。抗衰老的研究是现代医学研究的焦点和热点。目前的研究认为，人类的衰老与氧自由基的损伤有关，衰老的自由基学说已得到公认。氧自由基的损伤作用是神经细胞凋亡发生的重要机制之一。maFGF是多功能生长因子，具有多种生物活性作用［1］。本文通过观察maFGF对D-半乳糖致衰老大鼠脑组织中SOD活力、MDA含量和羟自由基含量和神经细胞凋亡数目，研究衰老后脑组织中自由基含量变化与神经细胞凋亡数目之间的关系，探讨maFGF抗衰老的机制。

1 材料与方法

1.1 动物衰老模型与分组

取成年清洁级Wistar大鼠64只，由广西医科大学动物实验中心提供(动物合格证号:SCXK(桂)2009-0003)，雌雄各半，体质量250 g左右。衰老模型每日皮下注射D-半乳糖100mg/kg，注射D-半乳糖60d后，大鼠行动迟缓，毛色松散无光泽，自发性活动减少，形体瘦弱，呈现明显的衰老体征，证明衰老模型成功建立［2，3］。衰老模型模型建立成功的动物入选本实验。入选48只Wistar大鼠随机抽签法分为衰老模型组、NS对照组和maFGF治疗组，maFGF治疗组皮下注射D-半乳糖的同时，1h后按12 μg/kg剂量肌肉注射，1次/d，共14d，maFGF由广州暨南大学生物工程研究所提供;NS对照组皮下注射D-半乳糖的同时，1h后肌肉注射与maFGF治疗组相同容量的生理盐水，1次/d;衰老模型组只皮下注射D-半乳糖，不作任何干预。另外16只大鼠不注射D-半乳糖，作为正常对照组。各组动物饲养环境、条件均相同:分笼普通饲养，自由饮水摄食。室温26℃，湿度50% ～60%饲养。

1.2 标本采集

各组大鼠到相对应的时间点断头处死迅速取出大脑，切块、固定、常规乙醇脱水及浸蜡包埋、切片，行TUNEL法检测神经细胞凋亡数(6只)。各组另10只迅速取出脑组织，用生理盐水洗去表面残血，取出脑组织制成脑组织匀浆，1500r/min离心10min后取脑组织上清液待测定。

1.3 脑组织中SOD活力、MDA含量和抑制羟自由基能力的测定

用UV-1700紫外可见分光光度计，在波长为550nm比色测定脑组织上清液各管吸光度值，SOD活力检测采用黄嘌呤氧化酶法，然后根据试剂盒说明书的计算公式算出组织中SOD活力，结果以U/mgprot表示。在波长为532nm比色测定脑组织上清液各管吸光度值，MDA含量检测采用硫代巴比妥酸法，然后根据试剂盒说明书的计算公式算出组织中MDA含量，结果以 nmol/mgprot表示。在波长550 nm处测定吸光度，运用公式计算得到抑制羟自由基能力，规定每毫克组织蛋白在37℃下反应1min，使反应体系中的H2O2的浓度降低1mmol/L为一个抑制羟自由基能力单位。抑制羟自由基能力越高，则反映肝脏组织样品中羟自由基的含量越低。脑组织匀浆蛋白定量按采用考马斯亮蓝染色法测定。SOD试剂盒、MDA试剂盒和羟自由基测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 细胞凋亡检测

采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记(TUNEL)法，TUNEL试剂盒由宝生物工程有限公司提供，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。凋亡细胞以细胞核呈棕黄色着色为阳性细胞(DAB法)。图像采用德LEICA公司的病理图像分析仪采集和分析，每切片在高倍(×400)镜下选择不重复的5个视野，各组切片选取部位尽量一致，计数每个视野TUNEL染色阳性的凋亡神经细胞，取其均值为凋亡神经细胞数。

1.5 统计学分析

用SPSS13.0 for windows统计软件进行统计分析，所有数据以数据用表示，采用单因素方差分析，并做LSD法两两组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 maFGF对慢性衰老大鼠脑组织SOD活力、MDA含量和抑制羟自由基能力的影响

4个组间脑组织SOD活力和MDA含量差异有统计学意义(F=10.596，P ＜0.01;F=42.478，P ＜0.01)。衰老模型组和NS对照组与正常对照组相比，SOD活力均显著降低而MDA含量均显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.01);NS对照组与衰老模型组相比，脑组织SOD活力和MDA含量差异均无统计学意义(P＞0.05);maFGF治疗组与衰老模型组和NS对照组相比，SOD活力均明显升高而MDA含量均明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.01)。

4个组间脑组织抑制羟自由基能力差异有统计学意义(F=11.924，P ＜0.01)，即羟自由基含量差异有统计学意义。衰老模型组和NS对照组与正常对照组相比，脑组织抑制羟自由基.能力均显著降低，表明脑组织中羟自由基的含量高，差异均有统计学意义(P＜0.01);NS对照组与衰老模型组相比，脑组织抑制羟自由基能力无统计学意义(P＞0.05);maFGF治疗组与衰老模型组和NS对照组相比，脑组织抑制羟自由基能力均明显升高，表明脑组织中羟自由基的含量明显降低，差异均有统计学意义(P ＜0.01)。(见表1)。

2.2 maFGF对慢性衰老大鼠大脑皮质神经细胞凋亡的影响

4组间大脑皮质神经细胞细胞凋亡数差异有统计学意义(F=27.532，P ＜0.01)。衰老模型组和NS对照组与正常对照组相比，细胞凋亡数均显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.01);NS对照组与衰老模型组相比，细胞凋亡数差异无统计学意义(P＞0.05);maFGF治疗组与衰老模型组和NS对照组相比，细胞凋亡数均明显降低，差异均有统计学意义(P ＜0.01)(见表2)。

表1 maFGF对慢性衰老大鼠脑组织SOD活力、MDA含量和抑制羟自由基能力的影响(，n=10)

表1 maFGF对慢性衰老大鼠脑组织SOD活力、MDA含量和抑制羟自由基能力的影响(，n=10)

与正常对照组比较＊＊P＜0.01;maFGF治疗组与衰老模型组和NS对照组相比▲▲P＜0.01

组别 SOD活力(U/mgprot) MDA含量(nmoml/mgprot) 抑制羟自由基能力(U/mgprot)正常对照组衰老模型组NS对照组maFGF治疗组221.23 ±13.52 188.64 ±16.00＊＊193.36 ±17.44＊＊216.02 ±15.77▲▲8.85 ±0.94 13.24 ±1.24＊＊14.01 ±0.60＊＊9.57 ±0.95▲▲90.37 ±6.04 77.46 ±6.79＊＊75.25 ±7.73＊＊86.51 ±5.65▲▲

表2 maFGF对慢性衰老大鼠大脑皮质神经细胞凋亡数的影响(，n=6)

表2 maFGF对慢性衰老大鼠大脑皮质神经细胞凋亡数的影响(，n=6)

与正常对照组比较＊＊P＜0.01;maFGF治疗组与衰老模型组和NS对照组相比▲▲P＜0.01

组别 细胞凋亡数(个)正常对照组衰老模型组NS对照组maFGF治疗组21.17 ±3.31 36.50 ±4.14＊＊34.67 ±4.13＊＊24.33 ±3.16▲▲

3 讨论

我国已经步入老龄社会，随着人口老龄化趋势的加快，抗衰老研究日益受到重视。目前的研究认为，人类的衰老与氧自由基的损伤有关［4～7］，衰老的自由基学说已得到公认，该学说认为，由于诸多因素的作用，使体内产生过多的自由基，可对生物体内的蛋白质、核酸、脂质等产生抗氧化损伤，导致机体心、肝、肾、脑等重要器官损伤老化，最终出现衰老。D-半乳糖致小鼠亚急性衰老模型因其衰老变化明显，模型稳定，在抗衰老研究中广泛应用。一般认为给动物连续注射D-半乳糖后，因其代谢产物半乳糖醇不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响正常渗透压，导致细胞肿胀，致使动物组织出现衰老时的退行性变化及功能的改变。同时D-半乳糖在体内氧化产生的大量自由基超过机体的清除能力，可引发脂质过氧化作用，导致细胞膜损伤［8，9］。氧自由基是指由氧衍生出来的自由基及其产物，包括过氧化氢、羟自由基、超氧阴离子等，羟基自由基被公认是生物系统中最具活性的活性氧物种，能导致生物体内DNA，蛋白质和脂质氧化损伤。SOD属于金属酶，主要作用是歧化氧自由基，及时清除机体生成的过量自由基，以防自由基对组织细胞产生毒害作用，从而保护细胞免受氧自由基的攻击。SOD活力高低可间接反映机体清除氧自由基的能力。自由基攻击膜脂中的不饱和脂肪酸，使其发生氧化，脂质过氧化产物MDA就会升高。脂质过氧化是造成生物体氧化损伤的主要原因。通过测定体内MDA含量，可间接反映体内自由基对机体的可间接反映体内自由基对机体的损伤程度［10］。

研究表明［11，12］，氧自由基的损伤作用是神经细胞凋亡发生的重要机制之一。氧自由基引起的DNA损伤可激活P53基因引起细胞凋亡;氧自由基攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化直接造成细胞膜的损伤可诱导细胞凋亡;氧自由基的氧化应激可活化核转录因子NF-kB和AP-1，可加速细胞凋亡相关基因的表达，诱发细胞凋亡;氧自由基氧化应激引起细胞膜结构的破坏，可改变细胞膜的通透性使Ca2+内流增加，诱导细胞凋亡。酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)为体内广泛分布的具有多种生物学效应的细胞生长因子，对中胚层及神经外胚层来源的细胞具有促有丝分裂作用和化学趋化性，能够促进神经再生、血管生成、损伤修复，在细胞发育分化及肿瘤的形成中的作用已获得公认［13，14］。maFGF即是采用DNA重组技术，切除了aFGFI-25位氨基酸残基，将26和27位氨基酸替换为蛋氨酸而研制出的非促分裂突变体［15，16］。本研究结果显示，衰老模型组脑组织SOD活力显著降低，MDA含量显著升高，抑制羟自由基能力降低即羟自由基的含量升高，大脑皮质神经细胞凋亡数明显升高。说明衰老时，羟自由基的增多，攻击生物膜，因此脂质过氧化物生成增多，同时，自由基增多也加速细胞凋亡，为了清除过多的羟自由基，SOD水平也下降。经过用maFGF治疗慢性衰老大鼠后脑组织SOD活力显著升高，MDA含量和羟自由基的含量均明显降低，大脑皮质神经细胞凋亡数明显下降。说明maFGF起到降低自由基，提高脑组织的抗氧化能力，减少神经细胞凋亡，对细胞具有保护作用。

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