山楂叶总黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用研究

刘俊芳，连建学，李昌俊，郑瑶，郭莲军（.河南科技大学第一附属医院，洛阳市4700；.河南科技大学医学院，洛阳市 4700；.华中科技大学同济医学院，武汉市 4000）

山楂叶总黄酮（HLF）是从蔷薇科山楂属植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.Var.major N.E.Br或山楂G.pinnatifida Bge.的干燥叶中提取的活性成分。据国内众多文献报道，HLF主要具有降低血脂[1]、抗氧化[2]、抗心肌缺血缺氧[3，4]、抗血栓和降血压[5]等药理作用。关于HLF抗心肌缺血的报道较多，但其抗脑缺血及对神经细胞的保护作用少见报道。本文采用改良Zea Longa’s法复制大脑中动脉闭塞（MACO）模型，用神经功能评分评价大鼠脑缺血再灌注后行为障碍；用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法测定梗死灶体积；用相应试剂盒测定脑组织内丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活力，从整体、细胞等不同水平探讨HLF抗脑缺血、保护神经细胞的作用及可能机制，为脑缺血疾病的有效治疗提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

680型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；3500型台式高速冷冻离心机（日本Kubota公司）；BI-2000型图象分析系统（成都泰盟科技公司）；超低温（－80℃）冰箱（美国Thermo Revco公司）；DHW-600型电热恒温水浴箱（北京路业通达科技有限公司）；CX31型光学显微镜、DP10型实体显微镜、AX 70型显微照相装置（日本Olympus公司）；G5型照相机（日本佳能公司）。

1.2 试药

尼莫地平（德国拜耳公司，批号：BXCC80121）；HLF（晋城中晋药业有限公司，批号：20071203，纯度：95%）；白介素-1β（IL-1 β）放免药盒（南京建成生物工程研究所，批号：20080627）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）放免药盒（北京普尔伟业生物科技有限公司，批号：20080627）。

1.3 动物

SPF级成年健康SD大鼠72只，♂，体重190～260 g，由郑州大学实验动物中心提供（实验动物许可证号：SCXK（豫）2005-0001）。室温下适应性喂养1周后开始实验。

2 方法

2.1 模型的复制[6]

大鼠用10%水合氯醛（350 mg·kg-1）ip麻醉，仰卧固定，颈部正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘钝性分离肌肉和筋膜，直到分离出左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，用动脉夹暂时夹闭颈内动脉，结扎颈外动脉近心端及颈总动脉，然后在距颈总动脉近分叉3～4 mm处剪口，按体重选取适当直径自制线栓（180～230 g∶0.235 mm；230～260 g∶0.26 mm）自切口轻轻插入，插入深度（从颈内、外动脉分叉处计起）约为18～20 mm，固定鱼线，缝合皮肤。缺血2 h后，将栓塞线向外轻轻拔出10 mm左右。

假手术组按上述方法，栓塞线仅插至颈内、外动脉分叉处，而不阻塞大脑中动脉。在大鼠缺血再灌注期间进行Longa 5分制神经功能学评分，各组大鼠均在24 h后断头取脑，并进行相应的生化指标检测。

2.2 分组和给药

将SD大鼠随机均分成6组，即模型（等容生理盐水）、假手术（等容生理盐水）、尼莫地平（0.7 mL·kg-1）和HLF高、中、低剂量（50、25、12.5 mg·kg-1）组。ip给药，每天1次，连续给药6次。随机抽取各组其中6只大鼠用于通过神经功能评分来评价大鼠脑缺血再灌注后行为障碍及测定缺血区脑组织内MDA、NO含量和SOD活力；各组剩余的6只大鼠则采用TTC染色法测定梗死灶体积。

2.3 神经学评分[6]及脑梗死体积[7]测定

大鼠清醒后，观察其行为学变化，神经症状按Longa 5分制评分。评分标准：0分，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向栓塞对侧转圈；3分，行走时向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识昏迷。分数越高，表示大鼠神经功能障碍越严重。

脑缺血2 h再灌注24 h后，迅速断头处死大鼠，于冰盘上取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，分离左右半脑，取缺血侧半脑，后沿冠状面切成6～7片（约2 mm/片），立即置于2%TTC PBS中，37℃避光、温浴10～15 min。取出脑片置10%福尔马林液中固定24 h，正常脑组织为玫瑰红色，梗死部位为白色。染色后的标本拍照，用BI-2000图像分析系统处理，计算脑梗死体积占全脑体积的百分比。

2.4 大脑皮层及海马区病理切片

脑缺血2 h再灌注24 h，大鼠经心脏灌流固定后断头取脑，取缺血侧相同区域大脑皮层和海马区冠状切块，取中间切块梯度脱水、透明、浸蜡、包埋。常规4 μm连续冠状切片，隔四取一（间隔16 μm）为一套切片，进行HE染色。之后于光学显微镜下观察大脑皮层和海马区神经元的病理形态学变化。

2.5 缺血侧脑组织MDA、NO含量及SOD活力测定

大鼠复灌24 h后，断头取脑，剔除嗅球、小脑和低位脑干，在冰块上分离左右两侧大脑。取缺血侧半脑皮质300～400 mg，制备成20%的脑匀浆，4 ℃下3 000 r·min-1离心15 min，离心后取上清液，－70℃保存，待测。按试剂盒说明测定MDA、NO含量及SOD活力。

2.6 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件分析数据。所有数据以x±s表示。多组资料采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 HLF对模型大鼠神经行为障碍程度与脑梗死体积的影响

HLF高、中剂量组能显著改善模型大鼠神经行为障碍（P＜0.05），HLF低剂量组未能显著改善模型大鼠神经行为障碍；HLF高、中剂量组能显著减少脑梗死体积（P＜0.01），HLF低剂量组的脑梗死体积与模型组比较无显著差异。以上结果提示HLF干预效果与剂量呈正相关。TTC染色结果比较见图1；HLF对模型大鼠神经行为障碍程度与脑梗死体积的影响见表1（假手术组略去）。

图1 TTC染色结果比较A.假手术组（400×）；B.模型组（400×）；C.尼莫地平组（400×）；D.HLF低剂量组（400×）；E.HLF中剂量组（400×）；F.HLF高剂量组（400×）；a.假手术组（100×）；b.模型组（100×）；c.尼莫地平组（100×）；d.HLF低剂量组（100×）；e.HLF中剂量组（100×）；f.HLF高剂量组（100×）Fig1 Comparison of the results of TTC stainingA.sham group（400×）；B.model group（400×）；C.nimodipine group（400×）；D.HLF low-dose group（400×）；E.HLF middle-dose group（400×）；F.HLF high-dose group（400×）；a.sham group（100×）;b.model group（100×）；c.nimodipine group（100×）；d.HLF low-dose group（100×）；e.HLF middle-dose group（100×）；f.HLF high-dose group（100×）

表1 HLF对模型大鼠神经行为障碍程度与脑梗死体积的影响（±s，n＝6）Tab1 Effects of total flavonoids of Folium Crataegi on ethological score and volume of cerebral infarction in model rat（±s，n＝6）

表1 HLF对模型大鼠神经行为障碍程度与脑梗死体积的影响（±s，n＝6）Tab1 Effects of total flavonoids of Folium Crataegi on ethological score and volume of cerebral infarction in model rat（±s，n＝6）

与模型组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别模型组尼莫地平组HLF低剂量组HLF中剂量组HLF高剂量组脑梗死体积比/%15.77±2.67 2.91±3.11＊10.55±2.38 6.02±7.67＊3.33±3.87＊行为学评分缺血2 h 2.67±0.52 1.83±0.41＊2.50±0.55 2.00±0.63＊1.67±0.52＊＊再灌注后24 h 3.17±0.75 1.50±0.55＊＊3.00±0.63 1.67±0.52＊＊1.67±1.21＊＊

3.2 HLF对模型大鼠皮层及海马神经元形态学的影响

假手术组大脑皮层HE染色神经元核仁及胞质形态和结构正常，神经元呈圆形或椭圆形，胞体较大，染色质分布均匀着色深，神经细胞排列紧密。模型、尼莫地平和HLF高、中、低剂量组低倍镜（100×）下，缺血中心区脑组织结构变得疏松，呈空隙状或有空腔形成，着色较浅可见炎性细胞；高倍镜（400×）下可见神经细胞数明显减少，部分神经细胞只留其轮廓，胞质嗜酸性增强，核固缩深染，核仁和尼氏体消失，胞质少着色深，与周围神经组织有较大腔隙，总体表现为核固缩、碎裂、溶解等细胞坏死的特征。尼莫地平和HLF高、中、低剂量组神经细胞损伤程度均轻于模型组，其中以尼莫地平和HLF高剂量组改善最为明显。

假手术组海马结构正常，锥体细胞排列整齐，形态正常，细胞着色均匀，胞浆呈淡红色，胞核呈蓝色且清亮。模型组海马组织结构明显异常，锥体细胞排列紊乱，细胞间隙增宽，神经元变性明显。部分退变的神经元呈现凋亡特征：细胞皱缩成圆形或卵圆形；核染色质固缩、边集或碎裂；胞浆皱缩，嗜酸性增加。亦可见均质红染坏死物质和细胞核固缩、溶解等坏死特征。尼莫地平和HLF高、中、低剂量组神经细胞排列略紊乱，仍可见细胞皱缩和胞核固缩浓染现象，但程度较模型组明显减轻，其中以尼莫地平和HLF高剂量组改善最为明显。大鼠皮层和海马神经元形态学见图2。

图2 大鼠皮层和海马神经元细胞形态学（HE染色）A.假手术组；B.模型组；C.尼莫地平组；D.HLF低剂量组；E.HLF中剂量组；F.HLF高剂量组Fig2 Morphologic changes in cortex and hippocampus of model rats（HE staining）A.sham group； B.model group； C.nimodipine group； D.HLF low-dose group；E.HLF middle-dose group；F.HLF high-dose group

3.3HLF对模型大鼠缺血侧脑组织内MDA、NO含量及SOD活力的影响

与假手术组比较，模型组缺血脑组织内的MDA、NO含量显著升高，SOD活力显著降低（P＜0.01）；尼莫地平和HLF高、中、低剂量组缺血侧脑组织内MDA、NO含量显著降低，SOD活力增强（P＜0.01或P＜0.05），而且随着HLF剂量的增加，MDA、NO含量递减，SOD活力递增。HLF对模型大鼠缺血侧脑组织中MDA、NO含量及SOD活力的影响见表2。

4 讨论

本研究发现，HLF高、中剂量组能明显减少脑梗死体积（P＜0.01）；明显改善模型大鼠神经行为障碍（P＜0.05），且与尼莫地平组无明显差异；HLF亦可以改善因缺血引起的大脑皮层和海马区神经元的病理损伤，且HLF干预效果具有剂量依赖性。

脑缺血再灌注损伤是多因素参与的复杂的病理生理过程。一般认为与氧自由基生成过多、组织脂质过氧化、细胞内钙超负荷、兴奋性氨基酸（EAA）毒性、线粒体功能受损关系密切。缺血再灌注后，黄嘌呤氧化酶产生增多、中性粒细胞激活以及线粒体内单电子还原等原因，导致大量氧自由基产生。而自由基的过多生成是引起脂质过氧化、细胞内钙超载、EAA释放增加的关键因素，进而可引起不可逆损伤[7]。自由基可广泛攻击富含不饱和脂肪酸的神经膜与血管，引发脂质过氧化瀑布效应，产生碱基重新修饰、多核苷酸链断裂、蛋白质变性、多糖分子聚合或降解，使细胞结构的完整性被破坏，细胞膜的通透性改变、离子转运异常。细胞内钙超载可进一步损伤线粒体的功能，Ca2+还能激活钙依赖蛋白激酶，使胞内无害的黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶，生成大量氧自由基。另外，Ca2+也可活化iNOS，催化产生NO。NO增加具有双重作用，既有神经保护作用，又有神经毒性作用[8]。在缺血再灌注早期，NO有扩张血管、改善缺血组织血供、抑制血小板凝集、减轻缺血及再灌注损伤的作用；而在缺血再灌注后期，iNOS在脑缺血后的炎症细胞部位表达，产生大量的NO，其可与超氧阴离子形成过氧化亚硝酸，灭活线粒体的锰超氧化物歧化酶，促进大量自由基生成，介导氧化损伤，发挥细胞毒性作用。同时，NO也是极强的氧化剂，能直接氧化脂质，造成细胞损伤[9，10]。综上所述，自由基的过多生成、脂质过氧化、细胞内钙超载、EAA释放增加、NO细胞毒性作用等诸多因素相互促进，形成恶性循环，进而造成不可逆的细胞损伤。

表2 HLF对模型大鼠缺血侧脑组织中MDA、NO含量及SOD活力的影响Tab2 Effects of total flavonoids of Folium Crataegi on the levels of MDA and NO and SOD activity in ischemic side of brain in rats with cerebral ischemic-reperfusion injury

MDA是脂质过氧化过程中生成的醛类物质之一，其可作为交联剂促进核酸、蛋白质及磷脂的交联，改变生物大分子的功能，通过检测MDA的含量可以反映脂质过氧化的程度。在正常情况下，机体中有抗氧化酶的广泛分布，在防止氧代谢物的损伤中具有重要作用，这些抗氧化酶主要是SOD、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等多种自由基代谢酶。SOD可催化超氧自由基发生歧化反应，清除氧自由基，保护生物膜免受自由基的伤害[11]。生理情况下，氧自由基与氧化防御系统两者保持动态平衡。有文献[12，13]通过对能过度表达铜-锌超氧化物歧化酶的转基因小鼠研究脑缺血再灌注损伤情况时发现，与野生型小鼠比较，转基因鼠神经细胞凋亡减少，故可推测提高缺血组织内SOD水平、加强氧自由基的清除，对缺血再灌注损伤的减轻以及损伤修复是有益的。

本研究发现，HLF能明显降低缺血脑组织内MDA、NO含量，增强SOD活力，且具有剂量依赖性。提示HLF很可能通过减少自由基的生成、抑制脂质过氧化、加速自由基的清除、降低NO的细胞毒性，从而对脑缺血再灌注损伤有较好的保护作用。

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