不同林龄麻疯树林地土壤细菌分布特征1)

陈喜英 谷 勇

(中国林业科学研究院资源昆虫研究所，昆明，650224)

熊 智 殷 瑶 董 平

(西南林业大学) (中国林业科学研究院资源昆虫研究所) (中国石油天然气股份有限公司石油化工研究院)

土壤微生物对维持土壤系统稳定性、健康和质量非常关键［1］，对植物生长具有重要作用［2］。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分之一，微生物数量多，土壤生物活性强，土壤养分供给充足，可以作为评价土壤肥力的重要指标之一［3-6］。土壤中细菌、放线菌、真菌三大类微生物比例是土壤肥力的一个衡量指标，土壤中细菌、放线菌密度高，表明土壤肥力水平高。土壤微生物群落结构的变化会直接影响土壤功能的发挥［7］。目前，对麻疯树(Jatropha curcas L.)林地土壤细菌的研究少有报道，对林地土壤微生态环境的认识比较模糊。因此对不同林龄麻疯树林地土壤细菌进行研究很有必要，本研究采用空间序列代替时间序列的方法，探讨了位于永胜县不同发育阶段麻疯树林地土壤细菌数量及类群的变化，分析了其与土壤养分的关系，进一步为麻疯树林地土壤肥力的变化、养分的转化及麻疯树林地的健康评价提供科学依据。

1 试验地概况

试验地位于云南省丽江市永胜县热河，东经100°33'34.1″～100°36'44.9″，北纬 26°6'3.6″～26°15'31.0″，海拔 1 230 m，属低纬山地季风气候类型。年平均气温13.5℃，最冷月平均气温6.1℃，最热月平均气温19.0℃，极端最高气温32.3℃，极端最低气温-11.2℃。年平均降水924 mm，年平均日照时间2 403.6 h。年平均相对湿度67%。采样地的土壤植被等基本情况见表1。

2 材料与方法

土样的采集：2010年8月在永胜县从1～10、11～20、21～30年生麻疯树林地选择3块样地。采集麻疯树林地0～30 cm的土壤，5 cm为一个层次，共7个层次。采用土壤剖面取样法，自下而上取样，每层取2份样，每份大约取10 g，一份装入密封袋用于细菌的测定，另一份装在铝盒中用于含水率的测定［8］。同时在此剖面中取测定营养元素的土样，将各土层的样品混合在一起，在实验室自然风干后送到云南省林业科学院重点实验室进行分析。

主要仪器和试剂：细菌培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基，基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)购自北京百泰克生物公司。16SrDNA的PCR引物正向为27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAAGGCT-3';反向为 1492r：5'-TACGGCTACCTTGTTACGA CTTCACCCC-3'［9］。由上海生工生物工程技术公司合成。选择Hin dⅢ酶、HaeⅢ酶、Hin fⅠ酶进行酶切，所有的酶全部购自Fermentas公司。采用Bio-RAD的Gel Doc-2000凝胶影像系统观察电泳条带并拍照。

表1 样地的土壤植被概况

土壤含水量的测定：称取待测土样经105℃烘干8 h，至于干燥器中，待冷却后称质量，土壤含水量=(湿土质量-干土质量)/湿土质量 ×100%［10］。

土壤细菌的测定：①倒平板。将制备好的牛肉膏蛋白胨培养基和培养皿灭菌后，把培养基倒入培养皿中，凝固后成平板，备用。②制备土壤稀释液。从每个土层中称取土样1 g放入盛9 mL无菌水的试管中充分混匀，制成10-1的土壤悬液，然后按10倍法依次稀释至10-6。根据预实验，选择10-6的稀释液，做3个重复。③涂布、培养和计数。用移液枪从试管中抽取1 mL稀释液放入平板中，用无菌玻璃刮刀将接种物均匀的涂布开。将平板倒置于28℃的培养箱中培养，24 h计数一次，直到菌落数不再增加。根据公式：每克干土中菌数(个/g)=菌落平均数×稀释倍数/(1-土壤含水量)，计算每克干土中的微生物数量。④纯化。将每个土层长出的菌落根据颜色，透明度等外部特征进行筛选，将不同的菌落分别挑取少许细胞接种分离培养，直到长出单个菌落，此时转接到已制备好的装有培养基的试管中，待菌落完全长好后放在冰箱中4 ℃保存备用［11-14］。

土壤营养元素的测定：①有机质质量分数测定采用油浴外加热—重铬酸钾法。②有效氮质量分数测定采用康氏皿碱解扩散法。③有效磷质量分数测定采用硫酸—盐酸浸提—钼锑抗比色法。④有效钾质量分数测定采用1N醋酸铵浸提—ICP-AES(TJA)法测定［15］。

细菌DNA提取、16SrDNA的PCR及酶切：将3种林龄的土壤中提取的43个细菌接种到装有牛肉膏蛋白胨培养基(不加琼脂)的试管中，待浑浊度达到0.7左右进行细菌DNA的提取，细菌DNA的提取按照试剂盒中的步骤进行，提取出的DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测质量。PCR反应时的条件，95℃预变5 min，30个循环为95℃变性3 min，56℃退火30 s，72℃延伸3 min，最后72℃下终延伸10 min。扩增后的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测质量。扩增后的PCR产物选用 Hin fⅠ、HaeⅢ、Hin dⅢ3种酶进行酶切，Hin dⅢ和HaeⅢ一起进行酶切。酶切体系的条件，16S rDNA PCR产物10.0 μL，水16.0 μL，10 ×Buffer R 2.0 μL，Hin dⅢ 1.5μL，HaeⅢ 1.5μL;Hin fⅠ酶切体系的条件，16SrDNA PCR 产物 10.0 μL，水16.5 μL，10 × Buffer R 2.0 μL，Hin fⅠ1.5 μL，均在 37℃的水浴锅中酶切12 h。再用1.5%琼脂糖凝胶90 V电压电泳 1.5 h，检测条带并拍照［16-19］。

统计分析：细菌数量的计算用Microsoft Excel 2003处理，双因素方差分析和二元变量的相关性分析采用Spss17.0处理，类群的聚类在MVSP软件上进行［20-21］。

3 结果与分析

3.1 土壤细菌的数量分布

由表2可知，细菌数量在3种林龄间的差异显著(p＜0.05)，1～10年生的麻疯树细菌数量在各土层中均最多，21～30年生的麻疯树细菌数量在各土层中均最少。细菌数量在土壤表层、0＜土壤深度d≤5 cm、20 cm＜d≤25 cm之间差异不显著(p＞0.05)，土壤表层、0 ＜ 土壤深度(d)≤5 cm、20 cm＜d≤25 cm 与5 cm ＜d≤10 cm、10 cm ＜d≤15 cm、15 cm＜d≤20 cm、20 cm＜d≤30 cm之间差异显著(p＜0.05)，3种林龄中均表现为15 cm细菌数量最多，30 cm细菌数量最少。

表2 不同林龄麻疯树土壤细菌数量 107个·g-1

3.2 土壤细菌的类群组成

对从3个麻疯树林龄中提取出的土壤细菌43个类群扩增后的16SrDNA进行酶切(见图1，图2)。首先把电泳图谱的带型转换成0、1数据，用MVSP软件进行聚类分析。通过聚类分析表明(图3)，在相似系数100%时，3块样地中提取的43种细菌归属于37个类群。1～10年生的麻疯树林地有24 个类群，分别为 1、3、5、6、7、8、9、10、11、12、19、21、24、25、26、27、28、31、32、35、36、39、41、42 号菌。11～20 年生的麻疯树林地有22 个类群，分别为 1、2、3、4、5、8、9、10、11、12、13、15、16、19、21、24、28、32、35、37、41、43 号菌。21～30 年生麻疯树林地有 18 个类群，分别为 1、3、5、6、9、10、11、12、15、19、21、24、26、27、28、31、32、35 号菌。可见，随着林龄的增加，类群数越来越少，菌类组成也发生了改变。

3.3 土壤营养元素与细菌数量的关系

对不同林龄麻疯树林地土壤细菌数量与土壤营养元素进行二元相关性分析的结果表明，细菌与全钾、有效氮、有效钾、有效磷呈极显著性正相关，与全氮呈显著性正相关，与全磷相关性不显著，与有机质呈极显著负相关(表3)。

图1 细菌Hin dⅢ和HaeⅢ酶切电泳图

图2 细菌Hin fⅠ酶切电泳图

图3 麻疯树林地土壤细菌的聚类分析图

表3 麻疯树林地土壤细菌数量与土壤化学因子之间的相关性

4 结论与讨论

土壤细菌数量分布受当地气候条件、水份状况、土壤营养状况、土壤质地、植被组成和覆盖度的综合影响［22］。在不同发育阶段的麻疯树林地内，随着林龄的增加，土壤细菌数量呈现递减趋势。这和乔海莉对新疆天然胡杨林土壤微生物多样性的研究略有不同［23］，可能是因为随着林龄的增加，郁闭度和植株生物量增加，因此落叶增加，由于叶子里面含有毒性成分［24-25］，可能限制了某些细菌的生长，从而导致细菌数量下降，但具体抑制作用还有待于进一步研究。

土壤细菌数量的垂直分布也存在一定差异，通过方差分析可知，土壤深度对细菌数量影响显著，在10 cm＜d≤15 cm处分布较多，15 cm＜d≤20 cm处开始减少。20 cm土层以下虽然富含植物根系，但却蕴涵大量石块，土壤密度逐渐增大，孔隙度较小，因此细菌随土壤深度增加而逐渐减少。细菌多分布在5 cm＜d≤15 cm处，这与此处根系分布密集，根系分泌物多，孔隙度高，水分充足，为其提供了丰富的营养和适宜的生存条件关系密切。由于样地表面土壤干燥及表层根系分布较少，因此表层细菌的数量比5 cm＜d≤15 cm处的少。

细菌类群数与土壤肥力及林地健康状况有密切的关系［22］。各类群数量越少，使得土壤中营养元素循环速率和能量流动减弱，土壤生态环境变得越不利于细菌的繁殖和植物的生长［26］。本研究中随着林龄的增加土壤细菌类群组成产生了改变，各类群数量也呈现减少的趋势，说明土壤肥力有下降的趋势及土壤微环境不稳定。

对于该麻疯树生态系统，影响土壤细菌数量的土壤营养元素中，细菌数量与全钾、有效氮、有效钾、有效磷呈极显著性正相关，与全氮呈显著性正相关，因此全钾、全氮、有效氮、有效钾、有效磷在影响细菌的生长发育中起着重要作用，所以在以后的土壤管理中应加强这几种营养元素的补充;全磷的影响较小，由于3个林龄中全磷能够满足细菌的生长，因此相对其他因子相关性不显著，但还需要进一步研究，并且宜放大时间尺度和研究对象的范围;与有机质呈极显著负相关，有机质主要来源于麻疯树的枯枝落叶，因为枯枝落叶中含有有毒成分，可能产生化感作用，抑制细菌的生长，这还有待于进一步研究。

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