新型白菜细胞质雄性不育系6w-9605A的鉴定及利用研究

严承欢，施展，石仁贤，万正杰，徐跃进

（华中农业大学园艺林学学院/华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉，430070）

白菜（Brassica compestrisL.spp.pekinensis）为十字花科芸薹属白菜种，是我国重要蔬菜之一，栽培面积与产量均居首位。白菜为异花授粉作物，具有极强的杂种优势，利用杂种优势具有提高产量、改善品质、增强抗性等优点，因此优势杂交育种在白菜育种中占据着主导地位。杂种一代生产的主要途径为自交不亲和系和雄性不育系，但是利用自交不亲和系生产一代杂种存在亲本连续自交易产生生活力衰退、繁殖需人工剥蕾授粉、成本高等缺陷[1]，而细胞质雄性不育系易得到高质量杂种一代，且具有制种简单、应用方便、成本低廉等优点[2]，所以细胞质雄性不育成为生产大白菜杂种一代的理想系而被广泛应用。

关于白菜细胞质雄性不育系的选育及应用，前人已经做过很多研究并取得一些进展。柯桂兰等[3]以PolCMS为不育源，最早成功地育成了大白菜异质源细胞质雄性不育系CMS3411-7，并率先利用了细胞质雄性不育系配制了秦白4号[4]等杂种。魏宝琴等[5]以Ogura不育源完成了结球白菜雄性不育系的选育；孙日飞等[6]从国外引进了一个新型萝卜胞质白菜雄性不育材料NYCMS，经过多代回交转育，成功获得了花器正常、有蜜腺、结籽正常的不育株。

本研究采用的白菜细胞质雄性不育材料6w-9605A是以芥菜细胞质雄性不育hauCMS为不育源[7，8]，以白菜DH系6w-9605B为轮回亲本，通过种间杂交和连续回交，获得遗传稳定的BC6白菜细胞质雄性不育系6w-9605A。试验从细胞学和田间两方面对新型白菜细胞质雄性不育系6w-9605A BC6进行花粉活力及染色体数目鉴定，同时对各回交遗传世代的不育性和植物学表型性状进行综合鉴定，为白菜种质资源的研究及杂种优势的高效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为白菜细胞质雄性不育系6w-9605A BC6、保持系6w-9605B BC6。所有材料均由国家蔬菜改良中心华中分中心提供。

1.2 试验方法

①田间调查 3月中旬花开放后，在田间观察白菜细胞质雄性不育系6w-9605A和白菜保持系6w-9605B的植株和花器官形态，并拍照记录。

2009-2010年分别在武汉和兰州对白菜细胞质雄性不育系 6w-9605A F1，BC1，BC6进行了育性鉴定及套袋后结荚率的调查。对500个单株进行育性鉴定，统计结果表明，6w-9605A各回交世代的不育度和不育株率均为100%，且蜜腺正常，植株无黄化现象。

②TTC法花粉活力测定 取少数6w-102A花粉和6w-102B花药于载玻片上，花药用镊子夹碎，加 1～2滴 TTC溶液，盖上盖玻片。将制片于 35℃恒温箱中放置 15 min，然后置于低倍显微镜下观察，并拍照记录。凡被染为红色的则为活力强的花粉，淡红的次之，无色者为没有活力的花粉或不育花粉。

③花粉母细胞染色体数目观察 取白菜雄性不育材料6w-9605A BC6的小花蕾，用镊子剥取花蕾中的雌蕊，放于0.002 mol/L 8-羟基喹啉中22℃下处理2 h，蒸馏水冲洗2～3次，卡诺式（无水酒精∶冰醋酸=3∶1）固定24 h。于1 mol/L稀盐酸中解离8～10 min（60℃），蒸馏水冲洗几次后置于洁净的载玻片上，吸水纸吸取其周围多余水分，解剖针充分压碎，改良苯酚品红染液染色5～8 min压片，在Olympus CX41显微镜下观察，Mshot MD30摄影。

2 结果与分析

2.1 白菜细胞质雄性不育系和保持系表型鉴定

白菜细胞质雄性不育系6w-9605A花朵开放正常，与保持系6w-9605B的花朵颜色一致，且蜜腺正常，6枚雄蕊分两轮，外轮2枚雄蕊的花丝较短，内轮4枚较长（图1A、图1D）。6w-9605A的柱头明显高于雄蕊，雄蕊花丝短，花药干瘪呈三角形（图1A），且无花粉，败育彻底（图1B）；6w-9605B的柱头略高于雄蕊，雄蕊花丝较6w-9605A长，花药呈盾形，且饱满有明显淡黄色花粉（图1D），花粉活力为 100%（图1E）。田间观察6w-9605A苗期植株，发现并无黄化现象，与6w-9605B相似，说明已基本转育成功（图1C、图1F）。

2.2 白菜细胞质雄性不育系各世代田间育性调查

对白菜细胞质雄性不育系6w-9605A F1、BC1、BC6的300个单株进行了育性鉴定及套袋后结荚率的调查，发现不育度和不育株率均为100%，说明白菜细胞质雄性不育系6w-9605A各世代败育彻底（表 1）。

2.3 大白菜细胞质雄性不育系回交后代的染色体数目

通过对大白菜细胞质雄性不育系6w-9605A BC6的花蕾进行染色体压片观察，发现BC6染色体数为20（图2），随着回交代数的增加，大白菜细胞质雄性不育系6w-9605A回交6代的染色体数目与大白菜的染色体数已趋于相同。

图1 白菜细胞质雄性不育系6w-9605A及保持系6w-9605B的表型

表1 白菜细胞质雄性不育系6w-9605A各世代育性鉴定

3 小结与讨论

细胞质雄性不育系的来源通常有2种：一是自然繁殖过程中发生的突变或品种间杂交产生的同源细胞质雄性不育，如polCMS；二是种属间远缘杂交形成的细胞质和细胞核基因重组而导致的异源细胞质雄性不育[9]。

图2 大白菜细胞质雄性不育系6w-9605A的染色体（2n=20）

HauCMS是傅廷栋教授1999年发现的天然芥菜型油菜细胞质雄性不育型。本研究以大白菜DH系6w-9605B为轮回亲本，通过种间杂交和连续回交，获得遗传稳定的大白菜细胞质雄性不育系6w-9605A BC6。芥菜型油菜的基因型为AABB，染色体数目为2n=4X=36；大白菜为2n=2X=20，AA。回交转育中，轮回亲本的核基因不断替换非轮回亲本的核基因。随着回交世代的增加，6w-9605A的染色体条数趋于白菜染色体条数，说明其核已经被保持系核基因组替代，获得了遗传稳定的大白菜细胞质雄性不育系，这与张艳等[10]的研究结果一致。同时对白菜细胞质雄性不育系6w-9605A BC6进行花器官观察和花粉活力测定，发现6w-9605A的蜜腺正常，其花药呈三角形，干瘪无花粉，败育彻底。

连续3 a在武汉与兰州调查白菜细胞质雄性不育系 6w-9605A F1、BC1、BC6的不育度和不育株率，发现各回交世代不育株率和不育度均为100%，说明6w-9605A败育彻底，且苗期不黄化，可以作为大白菜细胞质雄性不育系的种质资源，从而进一步加以利用，这为细胞质雄性不育在大白菜杂种优势利用中提供了种质资源和理论依据。

[1]刘玉梅，方智远，孙培田，等.十字花科作物雄性不育性获得的主要途径及其利用[J].中国蔬菜，2002（2）：52－55.

[2]陈夫贵，赵利民，巩振辉，等.新型大白菜细胞质雄性不育系RC7的不育机理分子机理探讨[J].安徽农业大学学报，2008（3）：311－314.

[3]柯桂兰，赵稚雅，宋胭脂，等.大白菜异源胞质雄性不育系CMS3411-7 的选育及应用 [J]. 园艺学报，1992，19（4）：333-340.

[4]柯桂兰，赵稚雅，宋胭脂，等.秦白4号大白菜的选育[J].陕西农业科学，1996（4）：12-14.

[5]魏宝琴，魏毓棠.Ogura不育源结球白菜雄性不育系的选育[J].中国蔬菜，1995（5）：18-21.

[6]孙日飞，钮心恪，司家钢，等.新型萝卜胞质白菜雄性不育系研究初报[J].中国蔬菜，1997（4）：32-33.

[7]万正杰，王显军，傅廷栋，等.芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A的细胞学观察[J].中国油料作物学报，2006，28（3）：268-271.

[8]Wan Z J,Jing B,Tu J X,et al.Genetic characterization of a new cytoplasmic male sterility system (hau)inBrassica junceaand its transfer toB.napus[J].Theor Appl Genet,2008,116(3):355-362.

[9]Schnable P S,Wise R P.The molecular basis of cytoplasmic male sterility and fertility restoration[J].Trends in Plant Science,1998,3(5):175-180.

[10]张艳，王小佳，李成琼，等.甘蓝细胞质雄性不育材料分子鉴定及花器官形态对核背景的响应 [J].园艺学报，2010，37（6）：915－922.