三氯甲烷和乙醇对转基因成分检测的抑制

王 东 ， 宋 君 ， 尹 全 ， 陶 李 ， 雷绍荣 ，刘 勇

（1.四川省农业科学院分析测试中心，四川 成都 610066；2.农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心（成都），四川 成都 610066）

0 引 言

随着近年生物技术的迅猛发展，大豆、玉米、棉花、油菜等100多个转基因作物品种已经商业化种植[1]。据不完全统计，由转基因作物加工生产的转基因食品约达4000种[2（]其中豆制品最多），包括部分食用油、酱油、番茄酱、薯条（片）、玉米片、汉堡包等。转基因产品的食用安全问题，虽然一直受到世界各国政府和公众的极大关注[3]，但目前没有科学证据表明食用转基因产品对身体有害。目前很多国家对转基因产品实施标识管理，因此，转基因产品的检测鉴定已成为各主要贸易国的一项重要工作[4]。

在转基因成分检测的DNA分离纯化过程中，三氯甲烷和乙醇往往不能完全除尽而成为后期PCR反应的抑制剂。迄今，关于三氯甲烷和乙醇这2种有机试剂在转基因食品安全检测中的抑制作用未见报道。该文以抗除草剂（CP4-EPSPS）转基因大豆（GTS40-3-2）为研究材料，模拟三氯甲烷和乙醇在反应体系中的残留，探讨这2种有机试剂的残留量对Lectin基因扩增的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

抗除草剂（CP4-EPSPS）转基因大豆GTS-40-3-2，购自欧盟标准物质和计量研究所（institute for reference materials and measurements，IRRM）。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的分离纯化

采用GB/T 19495.3-2004《转基因产品检测核酸提取纯化方法》附录C中CTAB法提取DNA[5]。

1.2.2 Lectin基因扩增

采用GB/T 19495.4-2004《转基因产品检测核酸定性PCR检测方法》的引物和反应条件[6]。扩增转基因大豆内标基因Lectin引物序列，former：5′-GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3′，reverse：5′-GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3′。扩增条件：预变性为95℃ 10 min，1个循环；PCR反应为95℃20s，60℃ 40s，72℃ 40s，共 40 个循环；延伸为 72℃3min。

1.2.3 三氯甲烷残留的PCR反应体系

25 μL反应体系，各成分终浓度为2×Taq PCR Master Mix（Tiangen 公司）12.5 μL，上、下游引物0.4 μmol/L，DNA 模板 2 ng/μL，三氯甲烷摩尔浓度梯度见表1，最后补充灭菌超纯水至总体积25 μL。

表1 三氯甲烷摩尔浓度梯度表

1.2.4 乙醇残留的PCR反应体系

25 μL反应体系，各成分终浓度为2×Taq PCR Master Mix（Tiangen 公司）12.5 μL，上、下游引物0.4μmol/L，DNA 模板 2ng/μL，乙醇浓度梯度见表2，最后补充灭菌超纯水至总体积25 μL。

表2 乙醇摩尔浓度梯度表

2 结果与分析

2.1 三氯甲烷对PCR反应抑制

转基因大豆GTS-40-3-2内标基因Lectin的扩增实验结果显示，未加三氯甲烷时，内标基因Lectin正常扩增，设置的空白对照正常，说明反应体系能正常工作，实验条件无污染。在25 μL反应体系中，逐次增加三氯甲烷的含量，其PCR反应受到的抑制作用也相应增强，直至PCR反应完全受到抑制。电泳结果显示如图1所示，在25 μL反应体系中，三氯甲烷的含量在 1～5 μL（0.50～2.51 mol/L）时，条带信号（亮度）逐渐减弱，但信号衰减不明显，表明PCR对三氯甲烷的耐受性较强，三氯甲烷对PCR有一定的抑制作用，但并不明显；当加入6～7μL（3.02～3.52 mol/L）三氯甲烷时，条带信号（亮度）衰减明显，说明PCR扩增反应在3.02～3.52 mol/L浓度范围内受到三氯甲烷明显的抑制作用；在反应体系中，当三氯甲烷含量达到 7.5 μL（3.77 mol/L）时，PCR扩增反应被彻底抑制。

图1 三氯甲烷对PCR反应的抑制作用

2.2 乙醇对PCR反应抑制

当未加乙醇时，设置的对照正常，说明转基因大豆GTS-40-3-2内标基因Lectin的扩增体系和实验条件符合实验要求。添加乙醇的实验结果表明，乙醇对转基因检测的PCR反应有较强的抑制作用，其抑制程度随乙醇浓度的增加而加大。在25μL反应体系中，当乙醇残留量未超过1μL（0.70mol/L）时，与不含乙醇的对照反应体系相比，扩增产物的信号衰减不明显，PCR反应受到的抑制作用较弱（图2）；当乙醇残留量超过1μL（0.70mol/L）时，扩增产物的信号衰减明显，PCR反应受到的抑制作用明显增强；25 μL 反应体系中乙醇残留量达到 2μL（1.39mol/L）时，PCR反应几乎完全受到抑制；超过此浓度时，则PCR彻底被抑制。

图2 乙醇对PCR反应的抑制作用

3 讨 论

对转基因产品的检测主要是基于核酸的PCR检测，转基因产品的PCR检测技术是国际认可的首选方法。基于常规PCR的转基因成分检测具有实验流程长、中间步骤多、易污染等特点。虽然转基因成分检测技术发展较为成熟，但仍然存在很多问题，尤其是未商业化转基因植物及产品的检测以及转基因产品DNA的分离与纯化，这2个问题已经成为转基因成分检测的瓶颈。

目前已经商业化生产的转基因产品种类多、数量大。转基因产品生产过程中，一般都要经过若干道加工程序，原料的理化性质发生很大变化，营养成分重新搭配同时引入了各种添加剂，在很大程度上增加了DNA分离与纯化的难度。常用的转基因产品DNA的分离与纯化方法主要有酚-三氯甲烷法、PVP法、CTAB法、硅土法、胍-三氯甲烷法等，其中三氯甲烷和乙醇是常用的2种有机试剂。乙醇易溶于水，DNA是水溶性物质，在DNA抽提中乙醇不易完全挥发，所以在转基因成分检测的后续PCR反应中往往残留了一定量的乙醇。三氯甲烷几乎不溶于水（25℃时，仅0.5%体积分数），但是由于在水相和有机相的分离、转移过程中，DNA水溶液中往往混合了少量的三氯甲烷。高质量（高浓度、高纯度）的DNA是PCR反应正常工作的首要条件，不含或者低含量的乙醇和氯仿等有机试剂的DNA模板直接影响转基因成分检测的成败。实验结果表明：当反应体系中存在的三氯甲烷摩尔浓度≥3.77 mol/L时，则会彻底抑制PCR的进行；和三氯甲烷相比，乙醇对PCR的抑制作用非常大，当在体系中加入1.39 mol/L的乙醇，就能使大部分DNA聚合酶失活从而抑制PCR反应，降低扩增效率。因此，在转基因食品DNA提取过程中，要特别注意转移DNA水相时不要吸到有机相，以免给后续步骤残留更多的有机试剂。在转基因食品DNA提取过程中，应多次纯化，最大限度地减少三氯甲烷等有机试剂在核酸中的残留。由于乙醚具有较强的挥发性，所以在转基因食品DNA纯化中，为了彻底除去DNA水溶液中残留的三氯甲烷等有机试剂，可以加入少量的乙醚帮助溶解三氯甲烷等有机试剂，最后挥发完全。在DNA提取中乙醇的完全去除也是很关键的一个环节。乙醇是DNA热聚合酶（蛋白质）的变性剂，PCR反应体系中乙醇的残留将会降低扩增反应效率或者抑制扩增反应，所以在DNA纯化完毕后应尽可能去除乙醇。

4 结束语

对转基因产品的检测方法主要是以针对外源蛋白的蛋白质检测方法和以外源基因为对象的DNA检测方法两大类。因DNA检测方法的准确性较高和适用范围相对较大，所以在实际检测工作中常用DNA检测方法[7]。高质量的DNA是保证转基因检测准确的关键和前提，因此，在DNA的分离和纯化过程中，应尽量减少三氯甲烷和乙醇等有机试剂的残留，最大可能地减少它们对PCR反应的抑制作用。

[1] 贾士荣.转墓因作物的安全性争论及其对策[J].生物技术通报，1999（6）：1-7.

[2] James C.2002 Global review of commercialized transgenic crops[EB/OL].[2002-10-10].http：//www.isaaa.org，2002.

[3] Office of Food Additive Safety.U.S.food and drug administration[EB/OL].[2002-10-10].http：//www.fdacfsan/biotech-nology.

[4] 宋君，王东，刘勇，等.转基因产品检测技术标准存在的问题及建议[J].中国测试，2009，6（35）：88-90.

[5] GB/T 19495.3—2004转基因产品检测核酸提取纯化方法[S].北京：中国标准出版社，2004.

[6] GB/T 19495.4—2004转基因产品检测核酸定性PCR检测方法[S].北京：中国标准出版社，2004.

[7] 邵碧英，陈文，江树勋，等.转基因产品检测方法概述[J].生物技术通报，2004，5（15）：516-518.