鸡痘DNA疫苗pV AX-env的构建及其体内外表达

洪 琴，任晓峰，李广兴

（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030）

鸡痘是由鸡痘病毒（Fowlpox virus,FPV）引起的一种急性接触性传染病，各年龄和品种的鸡都易感染，但雏鸡的敏感性最高[1]。鸡痘分为白喉型，皮肤型，和混合型。其特征是在鸡的无毛或少毛的皮肤上发生痘疹，或在鸡口腔、咽喉部黏膜形成纤维素性坏死性假膜。鸡只患该病后增重缓慢、消瘦，产蛋量暂时下降[2]。近年来，鸡痘鹌鹑化弱毒苗对鸡群进行刺种免疫，但常出现免疫失败，鸡群发生典型鸡痘或非典型鸡痘的报道，给养鸡户造成很大的经济损失[3-4]。目前国内外鸡痘疫苗研究主要集中于重组鸡痘病毒的构建，而对于鸡痘病毒DNA疫苗的研究几乎没有。鸡痘病毒囊膜蛋白由鸡痘病毒ORF140编码，为痘苗病毒H3L编码的P35蛋白的同系物，在痘病毒属内氨基酸序列高度保守。env蛋白对细胞内成熟病毒结合到细胞膜上起重要作用[5]。本试验选取鸡痘病毒env基因为目的基因,构建了含有该基因的真核表达质粒pVAX-env，并进行体外瞬时转染和体内免疫试验，经免疫荧光和RT-PCR检测证明pVAX-env在体内体外都能进行表达，为深入分析env蛋白功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株、细胞、真核表达载体

pVAX1、大肠杆菌JM109由本实验室保存，含有env基因的质粒本实验室构建，命名为pMD18-T-env。BHK21细胞由本实验室保存。

1.1.2 试剂

T4DNA连接酶、exTaqDNA聚合酶、dNTP、DNA限制性内切酶PstⅠ和XhoⅠ、M-MLV反转录酶、Oligod(T)、Rnase抑制剂、核酸分子质量标准等购自TaKaRa公司，Trizol和脂质体-2000购自Invitrogen公司，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。兔抗env蛋白多抗血清由本实验室制备，FITC标记的羊抗兔IgG(第二抗体)购于北京中杉公司。1日龄雏鸡购自东农孵化场。

1.2 方法

1.2.1 FPV env基因的亚克隆

根据pMD18-T-env的测序结果设计了两对亚克隆引物，ENV-PVAXU：AAAACTGCAGCCGCCA TGGCGCCGGGCGACA；ENV-PVAXL：CCCGCTC GAGTTACATAGAATACGCT。其中上游引物ENVPVAXU含有PstI酶切位点，并在起始密码子ATG前插入序列CCGCC构成Kozak序列。下游引物ENV-PVAXL含有XhoⅠ酶切位点。理论上可扩增993 bp。

以pMD18-T-env质粒为模板进行PCR扩增按照文献方法[6-7]采用25 μL体系：

10×PCR 缓冲液（含 2.5 mmol·L-1MgCl2）2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 2.0 μL， 2.5 U exTaq 0.25 μL，25 pmol·L-1的上下游引物各 0.5 μL，模板 0.5 μL，最后用双蒸水补至25 μL。

PCR条件为95℃预变性模板2 min；94℃变性1 min；53.9℃退火30 s；72℃延伸1 min共30个循环，72℃终延伸10 min，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

1.2.2 重组真核质粒的构建与鉴定

将上述PCR产物分别用PstⅠ和XhoⅠ双酶切，并与同样双酶切的融合表达载体pVAX1用T4DNA连接酶在16℃金属浴中过夜连接，将连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，挑取单克隆菌落小量制备质粒后进行菌液PCR和双酶切初步鉴定。

1.2.3 重组真核质粒的体外瞬时转染

将BHK21细胞接种于24孔板中，在细胞达到80%的融合时开始转染。取2 μg重组质粒和2 μL LipofectamineTM2000，分别用100 μL无抗生素、无血清DMEM培养液稀释；静置5 min后将两者混匀，室温孵育30 min，以便脂质体充分包裹质粒。然后转染BHK21细胞，24～48 h后用间接免疫荧光检测转染基因的表达。

1.2.4 间接免疫荧光检测重组质粒体外表达

瞬时转染24 h后取出盖玻片，按照文献[7]免疫荧光法检测目的蛋白表达：用0.01 mol·L-1预冷PBS（pH 7.2）清洗3次；用4%多聚甲醛溶液室温固定20 min，PBS清洗3次；冷丙酮4℃固定10 min，PBS漂洗。0.1%Triton-X100室温 5 min，PBS漂洗。然后加入兔抗env多抗血清1∶100稀释，37℃作用1 h，PBS清洗3次；加入1∶200稀释的FITC标记的羊抗兔IgG二抗，室温避光作用45 min，PBS清洗3次；再用中性甘油封片,荧光显微镜下观察表达情况，以同时转染PVAX空载体的BHK21细胞为阴性对照。

1.2.5 重组真核质粒的体内试验

碱裂解法大量制备真核表达质粒方法参照文献[8]。

14日龄商品蛋公鸡 (1日龄购自东农孵化场)30只分为两组。各组鸡只接种前15 min先在接种部位注射25%的蔗糖溶液100 μL轻柔5 min，第一组胸肌注射 PBS 100 μL只-1，第二组胸肌注射pVAX-env重组真核质粒100 ug只-1。注射后24 h，48 h，72 h，7 d，14 d分别采取注射部位的肌肉、皮肤、标记好于-80℃保存。

1.2.6 RT-PCR检测

Trizol法提取组织总RNA按照文献方法[9]，反转录合成cDNA。反转录反应体系为20 μL总RNA 10 μL，Oligod(T)2 μL，70 ℃ 10 min 冰上 2 min。RNase Inhibitor 0.5 μL，5×M-MV 缓冲液 4 μL，MMLV 酶 1.5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）1 μL，RNase free H2O。42℃水浴1 h,70℃15 min。以cDNA为模板，同1.2.1方法进行PCR扩增。

1.2.7 免疫组织化学检测重组真核质粒体内表达

取出组织，修成适当的小块，使用冰冻切片机把组织切成8～9 μm切片，粘附在APES处理过的载玻片上。室温干燥1 h，80%丙酮4℃固定过夜，室温干燥10 min后PBS清洗3次，10%马血清室温封闭20 min，一抗：兔抗env多抗血清1∶100稀释，室温孵育2 h。PBS清洗3次，孵育1∶200稀释的FITC标记的羊抗兔IgG二抗，室温避光1 h。PBS清洗3次，再用中性甘油封片，荧光显微镜下观察表达情况。

2 结果与分析

2.1 鸡痘病毒囊膜蛋白的亚克隆及重组质粒的构建

PCR扩增产物与预期大小一致，约993 bp。将其亚克隆到pVAX1载体上，得到重组质粒pVAX-env。通过菌落PCR和重组质粒双酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析得到一个约993 bp的条带，与预期的目的片段大小相符(见图1)。

图1 重组阳性质粒酶切鉴定Fig.1 Gel electrophoresis on enzyme digestion of pVAX-env

2.2 间接免疫荧光检测

通过细胞免疫荧光技术，在荧光显微镜下，瞬时转染pVAX-env质粒的BHK21细胞可以观察到特异性的绿色荧光信号主要分布在胞浆（见彩版Ⅰ），而瞬时转染PVAX空载体的BHK21细胞无明显的荧光信号（见彩版Ⅱ）。

2.3 RT-PCR检测pVAX-env的体内表达

提取免疫PVAX-env后和使用注射PBS的雏鸡免疫部位肌肉组织的总RNA，使用引物ENVPVAXU和ENV-PVAXL进行RT-PCR检测。结果显示，免疫后722 h即可检测到env的RNA，而PBS组无明显特异性条带（见图2）。

图2 体内表达试验RT-PCR结果Fig.2 RT-PCR identification of env mRNA in vivo expression experiment

2.4 组织免疫荧光检测pVAX-env的体内表达

取72 h pVAX-env组和PBS组带皮的肌肉组织制作冰冻切片，间接免疫荧光检测pVAX-env体内表达情况。pVAX-env组肌肉组织在肌膜、肌束膜（见彩版Ⅲ）和肌纤维间隙浸润的淋巴细胞胞浆内可见特异性的荧光（见彩版Ⅲ箭头）。而PBS对照组无明显荧光（见彩版Ⅳ）。

3 讨论与结论

近年来，在已免疫的鸡群中常有鸡痘的爆发。说明现用的鸡痘鹌鹑化弱毒苗不能提供针对鸡痘病毒的有效地保护。其爆发的原因包括新抗原变异株的出现；活疫苗弱毒株由于反复接种传代，可能出现毒力返祖，造成毒力增强而爆发鸡痘；还有一些报道鸡痘疫苗有REV污染引起REV相关疾病；在美国和澳大利亚的研究表明鸡痘分离株和疫苗株中整合有完整的REV前病毒[10]。整合有完整的REV前病毒的FPV可能加强感染雏鸡致病性。更有报道认为REV前病毒的整合早在50年前就已经发生了[4]。我国的研究也发现分离的野毒株中含有REV的前病毒基因序列,国产疫苗当中也整合有REV的LTR序列[11-12]。甚至重组鸡痘病毒疫苗也整合有REV前病毒序列。而且不同病原的重组鸡痘病毒 (rFPV)在

鸡群进行间隔性的多次免疫时，后期免疫会受到前期免疫所诱生的载体特异性免疫反应的干扰，并导致其免疫效力下降[13]。对于雏鸡体内的母源抗体对于鸡痘鹌鹑化弱毒苗和重组鸡痘病毒疫苗免疫有一定的影响[14]。DNA疫苗是一种新型的基因工程疫苗，它将含有编码某种抗原蛋白基因序列的重组质粒作为疫苗直接导入机体细胞内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，从而使被接种机体获得相应的免疫保护而达到防病治病的目的。其安全有效，使用简便，可长期在宿主细胞内表达而使机体获得持续性的免疫力且不受母源抗体的影响等优点而越来越受到人们的重视，被看作是继传统疫苗及基因工程亚单位疫苗之后的第3代疫苗[15]。鸡痘病毒FPV140编码病毒的囊膜蛋白没有保守的糖基化位点。一个短的N端疏水序列和一个长的C端疏水区在所有同系物中都保守。N端不是信号肽序列所以不能转移到内质网上，C端疏水区预测为跨膜区。这个疏水区是它到IMV膜入点。FPV140蛋白和VACV H3L蛋白一样，有丰富的碱性残基和包含潜在的硫酸乙酰肝素结合位点。这说明FPV140蛋白，像他的VACV同系物，能够有功能使IMV结合到细胞膜[4]。本试验构建了鸡痘DNA疫苗pVAX-env真核表达质粒，并成功的证明其在体内外都能获得表达，为进一步进行鸡痘病毒核酸疫苗的研究奠定了基础。

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