益生素雏鸡新城疫疫苗免疫后局部黏膜组织T淋巴细胞数量变化

吕晓萍,赵良友,于学武,郑世民

(1.东北农业大学动物医学学院,黑龙江 哈尔滨 150030;2.黑龙江中医药大学药物安全性评价中心,黑龙江 哈尔滨 150040;3.辽宁省动物疫病预防控制中心,辽宁 沈阳 110164)

益生素是指通过摄入适量从而对宿主产生有益作用的活菌[1]。益生素不仅可通过消化道发挥有益作用;还可外用于同样存在固有菌群的泌尿系统和皮肤。益生素的主要功能包括:保持正常菌群,对抗感染、抑制癌症和刺激免疫系统[2]。同时,除具有调节正常菌群达到促进健康作用外,还具有免疫调节作用,增强机体免疫功能[3]。随着养殖业的大规模发展,饲养者为了治疗动物疾病而滥用抗生素,导致动物体内致病菌产生耐药性,无法控制某些疾病的发展和蔓延。为改变这一现状,人们着力寻找能够替代抗生素的天然添加剂,以减少动物性食品中药物的残留。目前研究和使用最多的是各种益生素。益生素作为免疫增加剂、抗生素的替代剂和动物性食品的增重剂广泛应用于养殖业。本试验旨在通过对雏鸡局部免疫组织T淋巴细胞数量变化的研究,从细胞水平上检测局部黏膜组织细胞免疫功能变化,揭示雏鸡饲喂益生素、益生素与ND疫苗联合应用局部黏膜组织细胞免疫的变化规律。

1 材料与方法

1.1 试验动物 1日龄艾维因雏鸡100只,雌雄各半,购自哈尔滨某孵化场。经鸡传染性囊病、鸡马立克病和鸡传染性支气管炎等抗体检测均为阴性。

1.2 产酶益生素 山东华尔康生物技术有限公司,生产批号为饲添字(2007)11178号,按产品说明使用。

1.3 新城疫疫苗 LaSota弱毒苗(Ⅳ系),哈药集团生物疫苗有限公司,批号为200861,按产品说明使用。

1.4 试验动物分组及处理 100只雏鸡随机分为益生素组(简称P组)、ND疫苗免疫组(简称V组)、益生素ND免疫组(简称P+V组)和对照组(简称N组)4组,每组25只雏鸡,分别做如下处理:

P组雏鸡分别于1日龄和18日龄连续灌服生理盐水3 d,1次/d,并分别于10日龄和21日龄经点眼、滴鼻免疫新城疫弱毒苗,其中21日龄疫苗免疫剂量为10日龄的2倍。

P+V组雏鸡除将V组的灌服生理盐水改为灌服益生素外,其他处理与V组相同。

N组雏鸡分别于1日龄和18日龄连续灌服生理盐水3 d,1次/d,为正常对照。

1.5 试验材料的采取及处理 N、P、V、P+V组雏鸡分别于疫苗首次免疫后第0、7、14、28天和第42天,每组随机抽取5只雏鸡,心脏采血处死,快速采取哈德尔氏腺、盲肠扁桃体、十二指肠和回肠派伊尔结固定于4℃预冷的4%甲醛蔗糖缓冲液中,冰箱4℃固定24 h。

1.6 检测指标及方法 (1)切片制备:固定组织经流水冲洗后,分别于 70%、80%、90%、100%Ⅰ和100%Ⅱ丙酮逐级脱水(时间依组织块大小从30 min～60 min)、二甲苯透明、常规石蜡浸透、包埋和制片。(2)T细胞检测:盲肠扁桃体、哈德尔氏腺、十二指肠和回肠派伊尔结 T细胞数量检测应用ANAE染色法。(3)镜检计数:参考 Timo romppanen格点计数法[4],油镜检查免疫组织特定区域5个视野中的T细胞数量,以×103细胞/mm2表示。

1.7 数据处理 采用SPSS 13.0软件进行数据处理,比较各组间差异。

2 结果

2.1 益生素雏鸡ND疫苗接种后盲肠扁桃体T细胞数量变化

2.1.1 益生素雏鸡ND疫苗接种后盲肠扁桃体弥散区T细胞数量变化 雏鸡接种ND疫苗后,益生素ND免疫雏鸡盲肠扁桃体弥散区 T细胞数量分别于第14天、第7～14天和第7～28天明显高于ND疫苗单独免疫雏鸡、益生素雏鸡和对照雏鸡(P＜0.05或P＜0.01);益生素雏鸡和ND疫苗单独免疫雏鸡上述被检指标于免疫后7～28 d明显高于对照雏鸡(P＜0.05或P＜0.01);ND疫苗单独免疫雏鸡又于7～14 d高于益生素雏鸡(P＜0.01);其余未见统计学差异(P＞0.05)(表1)。

表1 益生素ND免疫雏鸡扁桃体弥散区T细胞数量变化 (×103个/mm2)

2.1.2 益生素雏鸡ND疫苗接种后盲肠扁桃体淋巴小结T细胞数量变化 雏鸡接种ND疫苗后,益生素ND免疫雏鸡盲肠扁桃体淋巴小结T细胞数量分别于第14天、第 7～14在和第7～28天明显高于ND疫苗单独免疫雏鸡、益生素雏鸡和对照雏鸡(P＜0.05或P＜0.01);益生素雏鸡和ND疫苗单独免疫雏鸡上述被检指标于7～28 d显著或极显著高于对照雏鸡(P＜0.05或P＜0.01);ND疫苗单独免疫雏鸡于免疫后7～17 d多于益生素雏鸡(P＜0.01);其余未见统计学差异(P＞0.05)(表2)。

2.2 益生素雏鸡ND疫苗接种后哈德尔氏腺T细胞数量变化

2.2.1 益生素雏鸡ND疫苗接种后哈德尔氏腺分泌管周围T细胞数量变化 雏鸡接种ND疫苗后,益生素ND免疫雏鸡哈德尔氏腺分泌管周围T细胞数量分别于第14天和第7～28天较益生素雏鸡和对照雏鸡显著增多(P＜0.05或P＜0.01),益生素雏鸡和ND疫苗单独免疫雏鸡分别于第14天和第7～28天明显高于对照雏鸡(P＜0.05或 P＜0.01),ND疫苗单独免疫雏鸡于免疫后第14天极显著高于益生素雏鸡(P＜0.01);其余未见统计学差异(P＞0.05)(表3)。

表2 益生素ND免疫雏鸡盲肠扁桃体淋巴小结T细胞数量变化 (×103个/mm2)

表3 益生素ND免疫雏鸡哈德尔氏腺分泌管周围T细胞数量变化 (×103个/mm2)

2.2.2 益生素雏鸡ND疫苗接种后哈德尔氏腺集合管周围T细胞数量变化 雏鸡接种ND疫苗后,益生素ND免疫雏鸡哈德尔氏腺集合管周围T细胞数量于第14天极显著高于益生素雏鸡和对照雏鸡(P＜0.01);ND疫苗单独免疫雏鸡分别于免疫后第14天和第14～28天明显高于益生素雏鸡和对照雏鸡(P＜0.05或P＜0.01),其余未见统计学差异(P＞0.05)(表4)。

表4 益生素ND免疫雏鸡哈德尔氏腺集合管T细胞数量变化 (×103个/mm2)

2.3 益生素雏鸡ND疫苗接种后肠派伊尔结T细胞数量变化

2.3.1 益生素雏鸡ND疫苗接种后十二指肠派伊尔结T细胞数量变化 雏鸡接种ND疫苗后,益生素ND免疫雏鸡十二指肠派伊尔结T细胞数量分别于第14天和第14～28天明显高于益生素雏鸡和对照雏鸡(P＜0.05或P＜0.01);ND疫苗单独免疫雏鸡分别于免疫后第14天和第7～14天显著或极显著高于益生素雏鸡和对照雏鸡(P＜0.05或P＜0.01),其余未见统计学差异(P＞0.05)(表5)。

表5 益生素ND免疫雏鸡十二指肠派伊尔结T细胞数量变化 (×103个/mm2)

2.3.2 益生素雏鸡ND疫苗接种后回肠派伊尔结T细胞数量变化 雏鸡接种 ND疫苗后,益生素ND免疫雏鸡回肠派伊尔结 T细胞数量分别于第14天和第7～28天明显高于益生素雏鸡和对照雏鸡(P＜0.05或P＜0.01);ND疫苗单独免疫雏鸡分别于免疫后第14天和第7～14天明显高于益生素雏鸡和对照雏鸡(P＜0.01),其余未见统计学差异(P＞0.05)(表6)。

3 讨论

益生素是良好的免疫增强剂,可提高机体细胞免疫和体液免疫,增强机体抵抗力[5]。在动物饲料中添加益生素,可促进机体免疫器官发育,提高T、B细胞数量,增强机体对抗原产生免疫反应,还可激活巨噬细胞、单核细胞等活性细胞分泌细胞因子,增强机体的抗病力[6]。研究发现[7],双歧杆菌可促进免疫活性细胞表面IL-6、IL-10和IFN-α等细胞因子的表达;应用乳酸杆菌和芽孢杆菌后,动物肠道黏膜底层细胞增加,淋巴细胞、巨噬细胞,自然杀伤性细胞的吞噬功能增强,分泌多种细胞因子,如IL-4、IL-6和IL-10等可促进SIgA合成,使肠道免疫屏障作用增强,从而提高机体抵抗感染能力[8]。

表6 益生素ND免疫雏鸡回肠派伊尔结T细胞数量变化 (×103个/mm2)

试验结果发现,雏鸡接种ND疫苗后,益生素ND免疫雏鸡和ND疫苗单独免疫雏鸡的哈德尔氏腺、盲肠扁桃体和回肠派伊尔结 TANAE+细胞数量分别于免疫后第14天、第7～14天和第7～28天明显高于未接种疫苗的益生素雏鸡和对照雏鸡(P＜0.05或P＜0.01)。表明ND疫苗接种提高了机体消化道局部黏膜的细胞免疫水平。产生上述变化的原因可能是:弱毒疫苗作为抗原进入机体后,首先被以巨噬细胞为主的抗原提呈细胞捕获,一方面对其加工处理,浓集抗原决定簇于细胞表面;另一方面分泌细胞因子IL-1,在MHCⅡ类分子作用下,辅助性Th细胞(CD4+)识别并接受相应抗原决定簇和IL-1刺激,活化淋巴母细胞,使T细胞数量增加。致敏的Th细胞表达IL-2受体,同时释放多种细胞因子,如 IFN-γ、IL-6、IL-10和 IL-13等,参与细胞免疫。未接种疫苗的雏鸡,因没有受到外源性抗原(弱毒疫苗)的刺激,机体局部免疫组织的T细胞并不致敏活化,不会大量增殖和分化,T细胞数量较接种了ND疫苗的雏鸡没有明显的增加趋势。

试验结果还发现,ND疫苗免疫42 d,益生素雏鸡上述免疫组织的TANAE+细胞数量不同程度高于未服用益生素的对照雏鸡,但无统计学差异(P＞0.05)。表明益生素可促进免疫器官发育和激发雏鸡局部黏膜组织的细胞免疫。产生上述变化的主要原因可能是:(1)益生素作为活菌制剂在雏鸡肠道表面定植与繁殖,当其增殖至一定数量时,可刺激机体免疫组织发育和免疫应答。(2)益生素在肠道内繁殖,不断合成免疫器官组织发育不可缺少的维生素和氨基酸等营养物质。(3)益生素自身组成成分,如脂多糖、肽聚糖和DNA等大分子释放到机体肠道内,直接刺激机体免疫器官发育和激发机体免疫应答。(4)益生素作为免疫增强剂作用于机体,活化了肠黏膜内相关淋巴组织,使肠道黏膜底层细胞增加,呈现淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞浸润,增强机体局部免疫功能。试验结果发现,益生素ND联合应用雏鸡的局部黏膜免疫组织TANAE+细胞数量均不同程度高于ND疫苗单独免疫雏鸡。其中益生素ND联合应用雏鸡盲肠扁桃体在免疫后第14天显著高于ND单独免疫雏鸡(P＜0.05)。表明益生素与ND疫苗联合使用,增强了雏鸡局部黏膜的细胞免疫功能和对ND疫苗的免疫应答。产生这种变化的原因可能是:益生素中含有芽孢杆菌、双歧杆菌和乳酸菌等,它们和弱毒疫苗抗原一样,作为外源性物质,共同刺激机体的局部黏膜免疫系统,使机体产生更强的免疫应答反应,也增强了机体对ND疫苗的免疫应答。

病原体侵染机体时,首先要突破机体与外界环境的屏障-黏膜表面。ND局部免疫部位也是NDV入侵门户,因此,通过黏膜途径激发的黏膜免疫在ND免疫中具有重要地位。益生素与ND疫苗联合应用提高ND疫苗的局部细胞免疫水平,在ND防治中有严重意义。

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