自体DC疫苗对恶性黑色素瘤术后患者免疫功能的影响

姚宇锋， 赖娅娜， 陈环球

恶性黑色素瘤(Maligant Melanoma，MM)是指来源于神经嵴的黑色素细胞在免疫缺陷、遗传因素及多种理化因素等影响下恶变而形成的一种恶性肿瘤。是一种高度恶性肿瘤，对放化疗不敏感，手术治疗是其主要治疗手段。近年来用树突状细胞(Dendritic cell，DC)疫苗治疗晚期恶性黑色素瘤的研究甚多［1-2］，但是国内外尚缺少DC疫苗治疗无远处转移的可根治手术MM的资料。为此，我们对2008年1月至2009年12月我科收治的12例肢体MM患者根治术后进行负载肿瘤细胞抗原的DC疫苗治疗，并与同期30例未接受DC疫苗治疗的肢体MM患者进行比较分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究共纳入42例进展期(Ⅱ、Ⅲ期)肢体MM患者，男22例，女20例，年龄33～67岁，中位年龄56.8岁。42例患者均行根治性手术治疗并经病理学证实为MM，影像学检查排除远处转移，KPS≥60分;血常规、肝肾功能、心肺功能基本正常。其中12例签署知情同意书接受常规免疫治疗联合DC疫苗治疗，其余30例患者仅接受常规免疫治疗。

1.2 方法

1.2.1 热休克凋亡MM细胞抗原负载的DC疫苗的制备和回输 按参考文献［3］方法进行DC疫苗的制备。按参考文献［4］方法进行DC疫苗的回输，每周注射1次，剂量为4×106细胞/次，共注射4次，部分患者注射5～8次。注射前按2005版《中华人民共和国药典》第三部规定的方法进行无菌和内毒素检测合格。

1.2.2 治疗方法 常规组术后只接受IL-2/IFNα-2b治疗方案。IL-2 200万U肌肉注射，qod;IFNα-2b 300万U肌肉注射，qod;1个月为1个疗程。IL-2及IFNα-2b间隔应用。治疗组在行上述方案治疗的进行DC疫苗注射，方法和剂量同前。

1.2.3 免疫学指标观察 分别在DC疫苗治疗前和结束1周后用流式细胞仪检测外周血 CD3+、CD4+、CD8+等T淋巴细胞亚群、自然杀伤(nature kill，NK)细胞的比率及 IFN-γ+CD8+T细胞数量［5］，ELISA试剂盒(晶美生物工程有限公司)检测血清 IL-2、IL-10、IL-12、TNF-α 和 IFN-γ 的水平。DTH试验:DC免疫治疗结束1周时进行DTH(delayed type hypersensitivity)试验，用l mL青霉素试验注射器吸取0.2 mL制备好的DC悬液，于一侧上肢前臂内侧行皮内注射，同时在对侧前臂内侧皮内注射0.2 mL生理盐水作为对照。注射后48～72 h内通知患者观察注射部位有无红肿及硬，直径大于5mm者判断为DTH试验阳性。

1.2.4 安全性评价 在DC输注后30min及24 h观察局部及全身急性毒性反应并作及时处理，直至毒性反应消失或接受其他治疗。整个治疗过程中参照国家规定的《抗肿瘤药物急性与亚急性毒性反应分度级标准》观察患者是否出现不良反应并且动态监测患者血液细胞学和肝肾功能变化。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 免疫指标变化

联合DC治疗组在DC免疫治疗后外周血CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+及 NK 细胞比率较治疗前明显升高(P＜0.05)，且明显高于常规治疗组(P＜0.05)(表1);同时DC治疗后患者血清IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α 水平均较治疗前及常规治疗组显著上升(P＜0.05)(表2)。另外对常规免疫治疗联合DC组12例患者进行了IFN-γ+CD8+细胞检测和DTH试验，7例患者治疗后IFN-γ+CD8+T细胞数量升高2倍以上，其中5例治疗后DTH试验呈阳性反应。

2.2 不良反应

表1 两组治疗前后T淋巴细胞亚群及NK细胞比率的变化(x ± s，%)

表2 两组治疗前后细胞因子的变化(±s，pg/mL)

表2 两组治疗前后细胞因子的变化(±s，pg/mL)

a:与DC治疗前比较，P＜0.05;b:与常规组治疗后比较，P＜0.05

常规治疗组常规治疗联合DC组指标治疗前 治疗后IL-2 33.86 ±14.34 38.38 ±13.23 34.13 ±12.61 54.86 ±16.43ab IL-10 41.78 ±13.27 43.82 ±12.35 42.87 ±13.64 44.96 ±16.32 IL-12 24.54 ±6.82 32.82 ±6.59 22.80 ±5.53 73.90 ±15.68ab IFN-γ 45.73 ±13.27 49.82 ±12.35 45.87 ±13.64 69.96 ±16.32ab TNF-α 21.07 ±6.63 22.74 ±6.59 21.80 ±5.53 75.90 ±15.63治疗前 治疗后ab

常规治疗联合DC组的12例患者，皮下注射后30 min内均未出现恶心、呕吐、头痛、寒战、高热等不良反应，3例患者在整个疫苗治疗过程中出现低热反应，未予特殊处理后恢复，4例患者出现注射局部红肿、硬结，给予对症处理后，红肿消失、局部硬结未出现扩大现象。所有患者均未出现严重的血液细胞学、肝肾功能的变化。上述结果显示DC疫苗注射是安全的，无明显毒副作用。

3 讨论

目前手术治疗仍是治疗MM最行之有效的方法。由于MM对放疗、化疗不敏感，病死率仍很高。近年来，生物治疗在恶性肿瘤治疗中的应用技术日趋成熟，如白介素-2(IL-2)，干扰素(IFN)等。而DC免疫治疗在恶性黑色素瘤治疗中的应用也越来越受到人们的重视。影响DC免疫治疗的因素很多，其中与MM临床预后有关的一个重要因素就是DC负载的肿瘤抗原［6］。DC疫苗的抗原负载体系有多种不同形式，如单个肿瘤抗原肽、混合肿瘤抗原多肽、肿瘤细胞裂解液、肿瘤细胞核酸等。与上述抗原制备方式不同的是，本研究采用热休克方式诱导肿瘤细胞凋亡，制备自体肿瘤抗原。由于热休克可以诱导肿瘤细胞高表达热休克蛋白(heat shock protein，HSP)，DC表面表达多种HSP受体(如CD91，CD40，TLR2/4或LOX1)，通过受体介导的内吞机制将使DC高效地摄取 HSPs-多肽复合物抗原，用富含HSPs的肿瘤细胞进行抗原负载可提升DC疫苗的效率［7］。本研究采用热休克凋亡的自体肿瘤细胞制备抗原，在避免肿瘤抗原缺失造成免疫逃避的同时提高DC疫苗的免疫原性，研究其治疗MM的临床应用价值。

外周血 中 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+比例、NK细胞比率的变化是反映人体特异性和非特异性免疫功能的重要指标，其中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+比例反映机体特异性免疫功能，NK细胞反映机体非特异性细胞免疫功能。本研究发现，12例患者在经过DC 疫苗治疗后 CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+及NK细胞比率明显升高，说明DC疫苗治疗能够提高MM患者的特异性和非特异性免疫功能，对于增强患者术后的抗肿瘤功能具有重要意义。

IL-2、IL-12、IFN-γ 和 TNF-α 在机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用，如 IL-2、IL-12刺激 NK细胞或CTL的杀瘤活性，IFN-γ具有较强的抗肿瘤和免疫调节作用，TNF-α可直接造成肿瘤细胞的凋亡，其中IL-2、IL-12 和 IFN-γ 均为 Thl细胞直接分泌［7］。肿瘤患者手术前后都可出现Thl反应向Th2的漂移(Th1/Th2 漂移)，机体出现 Thl弱势［8-9］，使机体的免疫功能进一步降低。本研究显示自体DC免疫治疗后，Th1 类细胞因子 IL-2、IL-12、IFN-γ 和 TNF-α的水平明显升高，而Th2型细胞因子IL-10的变化没有统计学意义，提示DC疫苗能诱导增强体内抗肿瘤细胞免疫，可激发肿瘤患者的Th1型免疫反应，有利于残余微小病灶的清除。有文献报道DC免疫治疗后DTH阳性及特异性T细胞免疫应答与患者的生存期有一定的相关性［10］。在本研究中，12例常规治疗联合DC组患者有7例患者治疗后IFN-γ+CD8+T细胞数量升高2倍以上，其中5例患者治疗后DTH试验呈阳性反应。

毒副作用的观察提示，在DC疫苗治疗过程中，仅少数患者出现低热反应及轻微的瘤苗注射局部的红肿、硬结，没有观察到严重的局部反应及血液细胞学、肝肾功能方面的明显变化。说明通过热休克肿瘤细胞后负载DC制备的DC疫苗以及疫苗的治疗方式对于患者是相对安全的，可以在临床推广应用。总之，我们的研究通过DC疫苗的免疫学效应证实，负载肿瘤细胞抗原的DC疫苗对于恶性黑色素瘤根治术后的辅助治疗是安全有效的。但是评价DC辅助治疗是否有效的最终指标是无病生存期和总生存期，因此我们将继续随访DC辅助治疗对于生存期的影响，以明确其临床价值。

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