农杆菌介导P2300-pa-8e抗虫基因转化马铃薯的研究

杨志超 张丽莉 卢翠华* 邸 宏 姜丽丽 张正国 林忠平胡鸢雷

（1东北农业大学农学院，黑龙江哈尔滨 150030；2北京大学生命科学学院，北京 100871）

马铃薯（Solanum tuberosumL.）是茄科茄属双子叶植物，是世界四大粮食作物之一，由于它具有适应性强、产量高、营养成分全和加工产业链长等特点，受到了全世界的广泛重视。我国是世界马铃薯生产第一大国，面积和总产量占全世界的1/4（卢翠华 等，2009）。

虫害是造成马铃薯减产的主要原因，其中金龟子科害虫金龟子（幼虫俗称蛴螬）是世界范围内广泛分布的地下害虫之一。金龟子成虫、幼虫均可危害马铃薯，但幼虫危害较大。传统化学药剂防治不仅危害人类健康，而且造成环境污染（姚庆学 等，2003）。自1996年转基因作物商业化以来，全球种植的抗虫转基因作物面积已经达到2 625万hm2（James，2008）。其中对金龟子科害虫具有杀虫作用的苏云金芽胞杆菌cry类基因的相继发现和克隆，为害虫的防治提供了新的途径。Yu等（2006）从Bt185中克隆了P2300-pa-8ea1基因。

本试验将来源于Bt菌株Bt185的P2300-pa-8e基因导入马铃薯中，期望获得抗虫的马铃薯材料，为马铃薯抗性育种提供新资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料和菌株

试验于2009年7月～2010年5月在东北农业大学马铃薯实验室进行。

供试马铃薯品种为早大白和克新18号（东北农业大学提供）。

供试农杆菌菌种为LBA4404（北京大学生命科学学院提供），植物表达载体质粒P2300-Pa-8e（图1），利用Patatin启动子驱动P2300-pa-8e（500 bp）基因的表达，质粒由北京大学生命科学学院林中平教授提供。

1.2 试验方法

1.2.1 工程菌液的制备 挑取含有质粒P2300-Pa-8e的农杆菌LBA4404单菌落接种于含有卡那霉素（Kan）、链霉素（Str）和利福平（Rif）的YEB培养基中，避光震荡培养。从中取500 μL菌液接种于50 mL相同的YEB培养基中，以相同条件震荡培养。到对数生长期，在4 000 r·min-1条件下离心5 min，弃上清液，重悬于MS液体培养基中，为工程菌液。

1.2.2 薯块再生培养基的筛选 将马铃薯早大白和克新18号脱毒微型薯灭菌、去皮，切成薄片，放入工程菌液中进行定时侵染，转入共培养培养基，28 ℃黑暗条件下培养 2～3 d。分别接种于9种再生培养基上（表1），诱导薯块出芽。待芽长到2～3 cm时剪下，转入生根培养基生根（丛培琳 等，2008；姜丽丽 等，2009）。

1.2.3 共培养时间对遗传转化的影响 在菌液OD600值为0.5、浸染时间为5 min的条件下，用农杆菌感染薯片，置于 28 ℃黑暗条件下分别培养1、2、3、4、5 d，在诱导培养基上培养20 d，统计抗性愈伤的诱导率。

1.2.4 PCR检测 使用索来宝公司的植物总DNA提取试剂盒提取马铃薯植株的总DNA，以转化植株的总DNA为模板，未转化植株的总DNA作阴性对照，以P2300-pa-8e质粒为阳性对照，根据P2300-pa-8e基因序列，设计特异性引物（PrimerⅠ：5′-GGCGGCAGCATTCAAACTCAA-3′，PrimerⅡ：5′-ATCTCCACCAAGATAGTGTCC-3′），对目标基因进行扩增。PCR体系（25 μL）：超纯水16.5 μL，25 mg·mL-1MgCl21.5μL，10×Buffer 2.5 μL，10 mmol·L-1dNTP 2.0 μL，10 μmol·L-1PrimerⅠ 0.5 μL，10 μmol·L-1primerⅡ 0.5μL，50 ng·μL-1模板1.0 μL，5 U·μLTaq酶0.5 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性8 min；94 ℃变性30 s，52.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸8 min；4 ℃终止反应。1%琼脂糖凝胶电泳检测。

图1 P2300-Pa-8e植物表达质粒结构示意图

表1 不同薯块再生培养基的激素配比

1.2.5 Southern-blot杂交检测 用SacⅠ酶切转基因植株DNA，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，经变性、中和，用高盐转移法（萨姆布鲁克，2002）将胶上的样品转移到尼龙膜上，以目的基因P2300-pa-8e为探针，采用地高辛试剂盒进行杂交、洗膜、显影。

1.2.6 转基因植株的移栽 将通过Southern-blot杂交检测的转基因植株培养15～20 d，炼苗后移入小盆中，放入温室培养，7 d左右转入网室培养。

1.2.7 抗虫试验 用转基因小薯与对照小薯分别喂养暗黑鳃金龟幼虫（3～4日龄）、华北大黑鳃金龟幼虫（3～4日龄）、黄粉虫幼虫和超级大麦虫幼虫。暗黑鳃金龟（3～4日龄）、华北大黑鳃金龟（3～4日龄）的幼虫采用室内杀虫活性测定（王容燕 等，2007），黄粉虫、超级大麦虫的幼虫采用饲料混合法（张杰 等，2002）进行生物测定。每处理 24头初孵幼虫，3次重复，置于光照培养箱中培养，分别于48、72、96 h记录死虫数，并计算校正死亡率。

2 结果与分析

2.1 共培养时间的确定

共培养时间的长短对遗传转化效率有影响，而且不同物种及外植体材料与农杆菌的最佳共培养时间也不同。从图2可以看出，早大白和克新18号薯片的共培养时间均在第3天时抗性愈伤组织诱导率最高，分别为92.16%和97.77%。

图2 共培养时间对遗传转化的影响

2.2 薯块再生培养基的确定

以MS为基本培养基，以早大白为试材，研究添加IAA和ZT两种激素对诱导马铃薯再生率的影响。试验结果表明（表2），使用M8培养基时，获得的出芽率最高，高达 93.55%；而使用M1培养基培养的薯块出芽率最低，仅有33.33%。因此，本试验条件下最优薯块再生培养基为M8（MS+4.0 mg·L-1ZT +1.0 mg·L-1IAA）。

表2 不同激素浓度配比对早大白薯块生长的影响

2.3 转基因植株与薯块的获得

马铃薯薯块经培养20～30 d后分化出芽。早大白接种薯块 36块，诱导产生再生植株 42株，有19株通过生根阶段筛选，抗性植株再生频率为52.78%；克新18号接种薯块32块，诱导产生再生植株54株，有21株通过生根阶段筛选，抗性植株再生频率为65.63%。将抗性植株移入网室，9月收获薯块（图3）。

图3 农杆菌介导克新18号薯块遗传转化再生植株与小薯的获得

2.4 PCR检测

对早大白和克新 18号所获得的抗性植株进行PCR鉴定，得到了约500 bp的特异性条带（图4），与阳性对照质粒的扩增结果一致，阴性对照没有特异性扩增条带。PCR检测结果初步表明，P2300-pa-8e基因已整合到受体基因组中。

图4 抗性植株PCR检测

2.5 Southern-blot杂交检测

将PCR检测呈阳性的植株进行Southern-blot杂交，使用SacⅠ对转基因植株DNA进行酶切，在5株早大白、10株克新18号PCR阳性植株中，4株早大白、6株克新18号有杂交信号（图5），其中4株为双拷贝，6株为单拷贝。不同植株外源基因插入位点不同，说明不同植株之间是相对独立的转基因植株。

图5 转化植株Southern-blot杂交检测

2.6 抗虫试验

以非转基因马铃薯为对照，测定P2300-pa-8e基因表达产物对暗黑鳃金龟、华北大黑鳃金龟、黄粉虫、超级大麦虫幼虫的毒力。结果表明，对暗黑鳃金龟、华北大黑鳃金龟龄幼虫7 d的校正死亡率分别为26.38%、34.72%；14 d的校正死亡率分别为47.22%、55.56%；而对黄粉虫、超级大麦虫幼虫均未表现活性。

3 结论与讨论

选择马铃薯微型薯作为外植体，遗传转化过程中具有再生速度快、出芽率高、易于操作等优点。

培养基中激素的组成和浓度是影响植株再生的关键，生长素和分裂素比例合适可以提高胚状体发生频率。从诸多马铃薯再生培养的报道中可以看出，所使用的外源激素大相径庭（张宁等，2004），用一种或几种培养基并不适合所有的品种。因此，需针对不同基因型选择诱导再生的激素种类和浓度。本试验使用MS+4.0 mg·L-1ZT+1.0 mg·L-1IAA为薯块再生培养基时获得的出芽率最高，高达93.55%。

适当的共培养时间能提高转化效率，本试验结果表明，共培养时间以外植体周围刚出现白色菌落时为最佳（一般共培养2～3 d），早大白和克新18号最佳共培养时间均为3 d。这样既可提高转化频率，又易于去除农杆菌。达到最佳生长状态的共培养时间则由农杆菌菌液的生长状态、菌液浓度、外植体类型及培养条件等决定。

对诱导生根的40株马铃薯抗性植株进行PCR检测，有14株呈PCR阳性反应，但都出现了非特异性扩增条带，其原因可能是：① 引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体。② Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多。③ 酶的质和量，有些来源的酶易出现非特异条带，而另一来源的酶则不出现；酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

经Southern-blot检测，有10株为转基因植株，表明在本试验中存在假转化体。分析原因可能有：① 外植体的表层细胞稳定表达外源选择抗性基因，为其他一些非转化细胞提供了一道屏障，逃避了选择压力的影响而继续分裂和分化。② T-DNA进入细胞后并没有整合到受体基因组中，而是以游离状态存在，导致PCR呈阳性反应。因此只有进行植物基因组的Southern-blot分析，才可以准确地了解外源基因在转化植株基因组中的整合情况。

本试验通过对薯块的抗虫试验，结果表明转基因马铃薯对鳞翅目害虫黄粉虫、超级大麦虫无活性，对鞘翅目害虫暗黑鳃金龟和华北大黑鳃金龟表现出抗性，为马铃薯抗性品种的培育提供了新的材料和方法。

丛培琳，卢翠华，邸宏，石瑛，张丽莉，姜丽丽，李文滨.2008.Bt-CryV基因对马铃薯的遗传转化.东北农业大学学报，39（9）：16-20.

姜丽丽，邸宏，林忠平，胡鸢雷，吴韩英，崔少彬，姜丽静，卢翠华.2009.蓝铜蛋白类似基因BcBCP1转化马铃薯及其抗旱性的改良.中国蔬菜，（2）：7-11.

卢翠华，邸宏，张丽莉.2009.马铃薯组织培养原理与技术.北京：中国农业科学出版社.

萨姆布鲁克 J，拉塞尔 D W.2002.分子克隆试验指南.3版.北京：科学出版社.

王容燕，王金耀，宋健，曹伟平，杜立新，冯书亮，宋福平，张杰.2007.铜绿丽金龟的室内人工饲养.昆虫学报，50（1）：20-24.

姚庆学，张勇，丁岩.2003.金龟子防治研究的回顾与展望.东北林业大学学报，31（3）：64-66.

张杰，宋福平，李长友，陈中义，檀建新，黄大昉.2002.对鞘翅目害虫高毒力Bt基因cry3Aa7的分离克隆及表达研究.中国农业科学，35（6）：650-653.

张宁，司怀军，李学才，王蒂.2004.根癌农杆菌介导的马铃薯高效遗传转化体系的研究.中国马铃薯，18（3）：132-135.

James C.2008.Global status of commercialized Biotech/GM crops.ISAAA Brief No.39.Ithaca NY：ISAAA

Yu H，Zhang J，Huang D F，Gao J G，Song F P.2006.Characterization ofBacillus thuringiensisstrain Bt185 toxic to the Asian cockchafer：Holotrichia parallela.Curr Microbiol，53（1）：13-17.