固本祛风颗粒中马兜铃酸Ⅰ的限量检查

俞 冰，刘志承，李曙光（深圳市中医院，深圳市 518033）

固本祛风颗粒是深圳市中医院协定处方，由黄芪、辛夷、细辛、桂枝等12味中药组成，临床用于治疗变态反应性鼻炎（又称过敏性鼻炎，属中医“鼻鼽”范畴），疗效确切。方中细辛为马兜铃科植物，可能含有马兜铃酸类成分，而马兜铃酸类成分具有细胞毒性且致突变性较强，能诱导DNA损伤，并能造成肾损伤[1～3]。为保证本品临床用药的安全性，笔者采用高效液相色谱（HPLC）法对固本祛风颗粒中马兜铃酸Ⅰ进行限量检查。

1 仪器与试药

20AT型HPLC仪，含LC-20AT型泵、AIL-20A型自动进样器、SPD-M 20A型二极管阵列检测器、CTO-10ASvp型柱温箱、CBM-20A型控制器、LC solution工作站（日本岛津公司）；AQUELIX 5型纯水机（美国密理博公司）；BP 211D型十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）；CQ-250-DST型超声波清洗仪（频率：40 kHz，功率：250W，上海跃进医用光学器械厂）。

甲醇、乙腈（色谱纯，美国Tidea公司）；磷酸、甲醇等试剂均为分析纯，水为高纯水；马兜铃酸Ⅰ对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110746-200507，供含量测定用）；固本祛风颗粒（深圳市中医院自制，批号：100901、100902、100903）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：GL Inertsil ODS-SP（150mm×4.6mm，5µm）；流动相：乙腈-0.05%磷酸（40∶60）；流速：1m L·min-1；柱温：28℃；检测波长：320 nm；进样量：10µL。理论板数以马兜铃酸Ⅰ峰计算应不小于5 000。在此色谱条件下，样品中其他成分对马兜铃酸Ⅰ峰无干扰。色谱见图1。

2.2 对照品溶液的制备

取马兜铃酸Ⅰ对照品适量，精密称定，加甲醇配制成浓度为97.20µg·m L-1的对照品贮备液。使用时加甲醇稀释成所需浓度的对照品溶液。

2.3 标准曲线的制备

取浓度为9.72 µg·m L-1的对照品溶液，分别进样2、4、6、10、15、20 µL，按“2.1”项下色谱条件进样，测定马兜铃酸Ⅰ的峰面积。以峰面积积分值（Y）对对照品进样量（X）进行线性回归，得回归方程为Y＝2 316.9X－1 050.5（r＝0.999 7，n＝6）。结果表明，马兜铃酸Ⅰ进样量在19.44～194.40 ng范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.4 精密度试验

取浓度为9.72µg·m L-1的对照品溶液连续进样6次，每次10µL，测定峰面积。结果，峰面积平均值为218 901，RSD＝0.34%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取浓度为9.72 µg·m L-1的对照品溶液，分别于第0、2、4、8、16、24 h进样10µL，测定马兜铃酸Ⅰ的峰面积。结果，峰面积平均值为217 723，RSD＝0.43%（n＝6），表明马兜铃酸Ⅰ在24 h内稳定性良好。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.供试品+对照品；D.阴性对照（缺细辛）；E.马兜铃酸Ⅰ检测限；1.马兜铃酸ⅠFig 1 HPLC chromatogram s A.substance control；B.test sample；C.substance control and test sample；D.negative sample（w ithout Asarum sieboldi）；E.detection limitof aristolochic acidⅠ；1.aristolochic acidⅠ

2.6 马兜铃酸Ⅰ检测限考察

取对照品溶液稀释、进样，至信噪比等于3，测得马兜铃酸Ⅰ的最低检测限为1.944 ng。

2.7 制剂中马兜铃酸Ⅰ检查

2.7.1 供试品溶液的制备 取本品，研细，取15 g（相当于细辛药材1.25 g），精密称定，置锥形瓶中，加甲醇50m L，精密称重，超声提取30min，放冷至室温，加甲醇补足失重，摇匀，0.45µm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.7.2 重复性试验 取同一批固本祛风颗粒，平行取样6份，按“2.7.1”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件进样检测，结果均未检出马兜铃酸Ⅰ。

2.7.3 加样回收率试验 精密称取本品15 g，平行6份，分别精密加入浓度为97.20µg·m L-1的对照品溶液5m L（相当于马兜铃酸Ⅰ0.486mg），按“2.7.1”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件测定马兜铃酸Ⅰ峰面积，计算加样回收率，结果见表1。

2.7.4 3批固本祛风颗粒中马兜铃酸Ⅰ检查 按上述方法检查3批制剂中的马兜铃酸Ⅰ，结果见表2。

结果表明，在本研究条件下，3批制剂中均未检出马兜铃酸Ⅰ。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Resultsof recovery tests（n＝6）

表2 制剂中马兜铃酸Ⅰ的检查结果（n＝3）Tab 2 Determ ination results of aristolochic acidⅠof samp les（n＝3）

3 讨论

马兜铃酸是一种菲类化合物，主要由马兜铃酸Ⅰ等化合物及其衍生物组成。马兜铃酸Ⅰ在甲醇、乙醇等有机溶剂中有较好的溶解性，故笔者采用甲醇超声提取样品，提取方法简便、可行。

笔者采用HPLC法测定固本祛风颗粒中马兜铃酸Ⅰ的含量，参照文献试用乙腈-0.4%冰醋酸（35∶65）[4]、甲醇-3.3%醋酸（75∶25）[5]、甲醇-水-冰醋酸（72∶27∶1）[6]、乙腈-0.05%磷酸（40∶60）作为流动相进行试验，结果乙腈-0.05%磷酸（40∶60）分离效果较好，故采用该流动相。

本试验测定结果表明，3批样品均未检出马兜铃酸Ⅰ。本方法操作简便，结果准确、可靠，可以作为固本祛风颗粒中马兜铃酸Ⅰ的限量检测方法。

[1]张晓明.马兜铃酸引起的肾脏损害[J].国外医学泌尿系统分册，2000，20（3）：102.

[2]曾美怡，李敏民，赵秀文.关于马兜铃酸类成分的毒性反应[J].中药新药与临床药理，1995，6（2）：48.

[3]Lord GM，Hollstein M，ArltVM，etal.DNA adductsand p53mutations in a patientw ith aristolochic acid-associated nephropathy[J].Am JKidney Dis，2004，43（4）：11.

[4]谢昭明，李顺祥，刘 杰.细辛不同部位马兜铃酸A的含量测定[J].中成药，2007，29（12）：1 808.

[5]任 薇，李少华，龙彦纲，等.HPLC法检查新生颗粒中马兜铃酸A的含量[J].中药新药与临床药理，2010，21（1）：67.

[6]吴 琳，苏维辉，周士臻.反相高效液相色谱法测定关木通水煎剂中马兜铃酸A含量[J].中国药房，2002，13（9）：551.