黄芩多糖体外抗新城疫病毒活性试验

王鑫滢，张秀英

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

现代药理研究表明，黄芩（Scuxiutellaria baicalensis Georgi）的粗提物及其活性部位、单体具有多种药理活性［1-2］，但对新城疫病毒（NDV）的作用目前未见报道。NDV可引发鸡和火鸡的急性、热性、败血性疫病，具有高度的接触传染性，严重危害世界养鸡业的发展［3-4］，目前兽医临床缺乏有效的防治药物。因此，研究开发出耐药性低、副作用和不良反应少的有效药物对新城疫的预防及治疗都具有重大的现实意义。本文通过对黄芩多糖的体外抗NDV的作用进行试验，为抗NDV的新型药物的研发打下基础。

1 材料与方法

1.1 鸡胚 新城疫病毒F48E9强毒株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；HA为1∶26。

1.2 药品与试剂 黄芩（黑龙江中医药大学），胰酶，优级胎牛血清，DMEM，四甲基氮唑盐（MTT），二甲基亚砜（DMSO），均来自Sigma公司。

1.3 主要仪器和设备 CO2培养箱（Thermo，德国），倒置显微镜（Nikon，日本），恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司），索氏提取器。

1.4 鸡成纤维细胞制备［3］取10日龄鸡胚，经取材、清洗、剪碎、再清洗、消化、吹打、过滤，在37℃CO2培养箱中培养24h，制成鸡成纤维细胞。

1.5 黄芩多糖的提取、分离、纯化［4］利用水提醇沉法提取黄芩多糖，Sevage法（氯仿∶正丁醇=5∶1），除去蛋白，透析除去无机物和大分子物质，真空干燥，即得黄芩多糖。

1.6 黄芩多糖对细胞安全浓度（TC0）的测定 在CEF中分别加入不同浓度的黄芩多糖，37℃CO2培养箱中继续培养，观察细胞病变情况，根据细胞病变程度（CPE）再结合 MTT法确定多糖对细胞的TC0。CPE的记录方法：“-”为没有细胞出现CPE；“+”为1%～25%的细胞出现CPE；“++”为26%～50%的细胞出现CPE；“+++”为51%～75%的细胞出现CPE，“++++”为76%～100%的细胞出现CPE。

1.7 黄芩多糖抗NDV的活性试验 在黄芩多糖安全浓度的基础上，将其进行倍比稀释，浓度分别为1∶2～1∶64，0.22μm滤菌膜过滤除菌后，进行以下操作：（1）先加多糖后接种病毒：将各浓度的多糖加入到CEF中，继续培养24h后取出，加入用维持液稀释成100TCID50的病毒液，100μL／孔。（2）先接种病毒后加多糖：将100TCID50的病毒液，100 μL／孔，加入到CEF中，继续培养2h后取出，然后加入各种浓度的多糖。（3）病毒和多糖同时加入：先将100TCID50的病毒液，100μL／孔，加入到 CEF中，紧接着加入各种浓度的多糖。

以上3组试验，加入各个浓度多糖和病毒液（多糖+病毒组）的为试验组；只加多糖不加病毒液的为多糖对照组；同时设病毒唑阳性药物对照组，加病毒唑（用维持液稀释终浓度为4000μg／mL，由预试验而定）；病毒对照组，加病毒液；细胞对照组，加维持液。100μL／孔，每种浓度重复4孔，另设一无细胞孔仅加维持液作为测定时调零孔，继续培养，每组以加入病毒液后计算时间，每隔12h观察一次CPE变化，直至病毒对照组出现典型的CPE（++++）病变后为记录终点，MTT法检测细胞OD值。

多糖抗病毒活性的评价标准：根据OD值统计，比较多糖+病毒组、病毒唑对照组与病毒对照组；多糖组与细胞对照组；多糖+病毒组与同浓度多糖组之间的OD值，判定多糖的抗病毒活性强弱。在多糖对细胞增殖无显著影响或显著抑制细胞增殖前提下，若多糖+病毒组OD值显著大于病毒对照组，且与同浓度中药组差异不显著，判为多糖具有显著的抗病毒活性；若多糖+病毒组显著大于病毒对照组且显著小于同浓度多糖组，或与病毒对照组及同浓度中药组差异均不显著，判为多糖具有一定抗病毒活性；若多糖+病毒组与病毒对照差异不显著，且显著小于同浓度多糖组，判为多糖无抗病毒活性［6］。计算药物的治疗指数（TI）=最大无毒浓度／最小有效浓度。TI值越高，多糖的安全性越高。

2 结果与讨论

2.1 黄芩多糖对细胞最大安全浓度的测定 见表1。

表1 加入各浓度黄芩多糖后各组细胞的细胞存活率

由表1的OD值变化可知，随着多糖浓度逐渐降低，细胞存活率逐渐升高，浓度在125.00μg／mL时细胞存活率达到97%，可初步认为对CEF的生长基本无影响，综合CPE和MTT结果可确定黄芩多糖对细胞的最大安全浓度为TC0=125.00μg／mL。

2.2 黄芩多糖抗病毒活性检测结果 见表2、3、4。

表2 先加药物后加病毒组的OD值变化

根据多糖抗病毒活性的评价标准：通过统计学方法分析可知多糖浓度为125μg／mL和62.5μg／mL时，具有显著的抗病毒活性；多糖浓度为31.25μg／mL及15.63μg／mL时，可以判定其具有一定的抗病毒活性；多糖浓度为7.81μg／mL时，可以判定为无抗病毒活性。黄芩多糖的TI=125／15.63=8。

表3 先加病毒后加药物组的OD值变化

根据多糖抗病毒活性的评价标准：统计学分析可知多糖浓度为125μg／mL和62.5μg／mL时，可以判定具有一定的抗病毒活性；其余各浓度的多糖，可以判定为无抗病毒活性。黄芩多糖的TI=125／62.5=2，这表明黄芩多糖直接杀灭NDV的作用较弱。

表4 药物与病毒同时加入组的OD值变化

3 讨论

通过NDV对鸡胚成纤维细胞的强力致病变作用特性，在此基础上对黄芩多糖抗NDV的活性进行了系统的试验。结果表明，黄芩多糖对NDV具有较好的预防及治疗作用，两种作用的治疗指数均达到8，同时表明黄芩多糖的药物安全性很高；但是黄芩多糖对病毒的直接灭活作用相对较低，治疗指数仅为2，可能是由于多糖对细胞的吸附能力较病毒弱，发挥实效较短。综合试验结果可知，如果进一步加深对黄芩多糖的研究与开发，有望研发出安全性高，毒副作用小，效果可靠的新型抗新城疫药物。

［1］贺海平.黄芩药理研究的新进展［J］.国外医学：中医中药分册，2000，22（1）：14-16.

［2］刘桦，吴晓冬，闫倩，等.黄苓苷对缺氧缺糖性心肌细胞的保护作用［J］.中国药科大学学报，2003，34（1）：55-57.

［3］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京：科学出版社，1997.

［4］刘云.当归多糖的提取及含量测定［J］.现代中药研究与实践，2003，17（1）：49-50.

［5］司徒正强，吴军正.细胞培养［M］.西安：世界图书馆出版公司，2004.

［6］胡元亮，孔祥锋，李祥瑞，等.10种中药成分对CEF的增值和抵抗 NDV感染的影响［J］.畜牧兽医学报，2004，35（3）：301-305.