经熊去氧胆酸治疗妊娠期肝内胆汁淤积症孕妇血清胆汁酸谱分析Δ

凌玲，刘兆明，邵勇#，王富兰(1.重庆市红十字会医院，重庆市40000；.重庆医科大学附属第一医院，重庆市400016)

妊娠期肝内胆汁淤积症(Intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是妊娠期特有的并发症。ICP对胎儿影响较大，可发生胎儿窘迫和妊娠晚期不可预测的胎儿突然死亡。目前治疗ICP的主要药物是熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid，UDCA)和腺苷蛋氨酸(S-adenosy-L-methione，SAMe)。国外大多推荐UDCA作为治疗的一线药物[1]。ICP最显著的生化异常是血清中胆汁酸水平升高。人体内代谢的胆汁酸主要为5类游离型胆汁酸，即胆酸(Cholic acid，CA)、鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)、去氧胆酸(Deoxycholic acid，DCA)、石胆酸(Lithocholic acid，LCA)和UDCA以及它们的甘氨(Glyco-，G)和牛磺(Tauro-，T)结合型胆汁酸[2]。ICP孕妇妊娠中晚期血清总胆汁酸明显升高，其中以甘氨胆酸(GCA)和牛磺胆酸(TCA)为主的结合型胆汁酸升高最为显著，游离型胆汁酸变化不大[3，4]。本研究采用高效液相色谱串联质谱(High performance liquid chromatography-tendem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)法检测UDCA治疗ICP孕妇的血清胆汁酸谱的变化，为临床的决策提供依据。

1 材料

1.1 仪器

API2000 HPLC-MS/MS仪，配备Perkin Elmer200泵和tubro离子源(加拿大Applied Biosystems公司)；Miliolpore真空泵和Waters part No WaT086344型吹氮装置(美国Waters公司)；DL-1型固相萃取器(国家色谱研究分析中心)；LD5-2A离心机(北京医用离心机厂)；SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；Libroafl-200天平(日本Shimadzu公司)；SB-3200超声波清洗器(宁波新芝科器研究所)；Modular 800全自动生化分析仪(瑞士罗氏公司)。

1.2 试药

CA标准品(批号:81-25-4，纯度≥98%)、CDCA标准品(批号:83-44-3，纯度≥99%)、牛磺石胆酸(TLCA)标准品(批号:345909-26-4，纯度≥95%)、LCA标准品(批号:434-13-9，纯度≥97%)、UDCA标准品(批号:128-13-2，纯度≥99%)、GCA标准品(批号:1192657-83-2，纯度≥97%)、TCA标准品(批号:345908-23-1，纯度≥95%)均购自美国Sigma-aldrich公司；甲醇、甲酸、乙腈、醋酸铵均为色谱纯。

2 方法

2.1 色谱及质谱条件[5]

色谱柱:菲罗门pH1-12柱(100 mm×2 mm，3 μm)；预柱:Luna C18(10 mm×2.0 mm，3 μm)；流动相:1/200乙酸水溶液(用氨水调节pH值至4.5)∶甲醇＝30∶70；流速:0.20 mL·min－1；柱温:35℃。

电喷雾电离源(ESI)选择性正离子检测，选择离子模式(SIM)方式检测；干燥氮气温度:200℃，雾化器流量:1.5 L·min－1；检测电压:1.40 kV。

2.2 研究对象

ICP组20例，正常对照组15例。所有ICP孕妇分别于治疗前及治疗后4周采集空腹静脉血5 mL，装于无菌普通生化管内，立即将新鲜静脉血标本在常温、普通气压下3000 r·min－1离心15 min，吸取血清2 mL至冻存管内，放入－70℃低温冰箱内冻存。检测血清胆汁酸谱、甘胆酸和肝功能。本研究标本采集获得重庆医科大学医学伦理委员会批准和受试者知情同意。

2.3 ICP诊断及纳入、排除标准[6]

2.3.1 ICP诊断及纳入标准:妊娠中晚期出现躯干、四肢等皮肤瘙痒，可伴或不伴黄疸；血清总胆汁酸(TBA)升高(＞10 μmol·L－1)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬酸氨基转移酶(AST)轻至中度升高(＞50 U·L－1)，总胆红素(TBIL)及直接胆红素(DBIL)正常或升高。

2.3.2 排除标准:肝胆B超排除肝胆疾病；乙肝病毒、丙肝病毒、巨细胞病毒和EB病毒标志物检查排除病毒性肝炎；排除合并其他疾病者；分娩后上述症状、体征、生化指标迅速恢复正常。

2.4 ICP治疗方案

所有ICP患者孕期26～32周入组，进入本研究前未行ICP药物治疗。治疗前及治疗4周后分别检测肝功能和胆汁酸谱。ICP组患者口服UDCA(德国Losan Pharma GmbH公司，规格:每粒250 mg)250 mg，每日4次，2周为1个疗程，本试验共进行2个疗程(4周)。治疗前及治疗后4周分别检测肝功能和胆汁酸谱。HPLC-MS/MS检测7种胆汁酸:CA、GCA、TLCA、TCA、UDCA、LCA、CDCA。

2.5 样品预处理与测定[5]

取血清300 μL于1.5 mL离心管中，加入乙腈溶液700 μL，涡旋振荡30 s，3000 r·min－1离心5 min，吸取上清液，吹干，加0.05%甲酸1.0 mL混合，用C18固相萃取柱萃取。用甲醇洗脱，60℃下氮气吹干，残渣用甲醇100 μL溶解，混匀，高速(15000 r·min－1)离心1.5 min。取20 μL进样分析，检测时间10 min。

2.6 方法学验证

方法学验证已有文献报道[5]。

2.7 统计学分析

所得数据输入SPSS16.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 ICP治疗组和正常对照组一般情况分析

ICP治疗组年龄(29.18±1.97)岁，正常对照组年龄(28.14±2.98)岁，2组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。

3.2 ICP治疗前、后孕妇血清肝功能指标分析

ICP治疗前与正常对照组相比较，TBA、ALT、AST、TBIL、DBIL有不同程度的升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)；ICP治疗前与ICP治疗后比较ALT、AST、TBIL、DBIL显著下降，差异有统计学意义(P＜0.01)。

3.3 ICP治疗前、后孕妇血清胆汁酸谱比较分析

ICP患者治疗前的血清胆汁酸谱CA、GCA、TCA、LCA和TLCA分别为:(3.7±0.35)、(4.2±0.64)、(8.4±1.73)、(0.13±0.02)、(0.09±0.02)μmol·L－1，显著高于正常对照组的(0.41±0.03)、(0.94±0.02)、(0.69±0.17)、(0.06±0.02)、(0.04±0.02)μmol·L－1，差异具有统计学意义(P＜0.05)；经UDCA治疗后，CA和GCA下降至(1.29±0.17)、(1.86±0.47)μmol·L－1(P＜0.05)，TLCA和TCA显著下降至(0.02±0.01)、(1.16±0.33)μmol·L－1(P＜0.01)，LCA无显著下降，而UDCA与治疗前比较升高了10倍(P＜0.01)；ICP经UDCA治疗后与正常对照组比较，UDCA极显著升高(P＜0.01)，CA、GCA、TCA分别有不同程度升高(P＜0.05)。ICP治疗前、后孕妇血清胆汁酸谱分析见表1。

表1 ICP治疗前、后孕妇血清胆汁酸谱分析(μmol·L－1，±s )Tab 1Serum bile acid chromatograms of ICPbefore and after treatmen(tμmol·L－1，±s )

表1 ICP治疗前、后孕妇血清胆汁酸谱分析(μmol·L－1，±s )Tab 1Serum bile acid chromatograms of ICPbefore and after treatmen(tμmol·L－1，±s )

ICP治疗前与正常对照组比较:＊P＜0.01，＃P＜0.05；ICP治疗前与ICP治疗后比较:☆P＜0.01，ΔP＜0.05；ICP治疗后与正常对照组比较:◆P＜0.01，□P＜0.05before treatment vs.control group:＊P＜0.01，＃P＜0.05；before treatment vs.after treatment:☆P＜0.01，ΔP＜0.05；after treatment vs.control group:◆P＜0.01，□P＜0.05

TCA 8.40±1.73＊☆1.16±0.33□0.69±0.17组别ICP治疗前ICP治疗后正常对照组例数/n 202015 LCA 0.13±0.02＃0.09±0.030.06±0.02 UDCA 0.32±0.03☆3.19±0.43◆0.25±0.13 CDCA 0.43±0.010.37±0.140.35±0.02 CA 3.70±0.35＊Δ 1.29±0.17□0.41±0.03 GCA 4.2±0.64＊Δ 1.86±0.47□0.94±0.02 TLCA 0.09±0.02＃☆0.02±0.010.04±0.02

3.4 妊娠结局分析

与正常对照组相比，ICP治疗组的羊水粪染率显著升高(P＜0.05)；早产率和Apgar评分≤7，差异均无统计学意义(P＞0.05)。本研究均无围生儿死亡发生。

4 讨论

ICP药物治疗目标是缓解瘙痒症状，降低血胆酸浓度，改善肝功能，从而降低高胆酸血症所致的胎儿窘迫和死胎的发生。UDCA通过内源性胆汁酸竞争，降低胆酸，改善胎儿环境从而延长胎龄，减轻瘙痒症状和降低生化指标，在胆汁中最具亲水性，其治疗ICP的机制主要有3方面:(1)保护胆管细胞免受疏水酸的细胞毒性作用，降低胆汁中胆汁酸的细胞毒性，降低胆管中疏水酸的浓度；(2)促进肝胆管的分泌，促进肝细胞膜上转运器的携带、转运功能；(3)保护肝细胞拮抗胆汁酸所诱导的细胞凋亡，抑制线粒体膜的转运通透性，增加其主动转运的能力[7～9]。Tribe等[2]研究发现，UDCA可以改善牛磺型和甘氨型疏水性胆汁酸的转运途径，从而使外周血中的牛磺型和甘氨型疏水性胆汁酸降低，减少肝细胞的损害，降低细胞的毒性作用。在本研究中，ICP患者接受UDCA治疗后与治疗前比较血清CA、GCA、TCA、TLCA均明显下降。ICP治疗前孕妇血清UDCA与正常对照组比较无明显升高，但是经UDCA治疗后，由于外源性UDCA的增加，治疗后UDCA水平明显升高，与正常对照组比较，差异具有显著性(P＜0.01)。Brites等[10]研究发现，与正常妊娠孕妇相比，ICP治疗前后LCA的浓度维持不变，但是LCA比例从(3.3±0.5)%增加到(7.4±1.3)%。与此不同的是，Lucangioli等[11]发现UDCA治疗的ICP患者LCA和TBA浓度降低了，未接受UDCA治疗的患者LCA浓度未改变，故认为LCA是更好的评价UDCA治疗ICP效果的指标。在本研究中，ICP患者与正常对照组比较，LCA和TLCA均明显升高，但在UDCA治疗后TLCA明显下降，LCA则无显著下降。

ICP时，由于孕妇高胆汁酸血症，胆汁酸盐沉积于胎盘，胎盘滋养细胞出现细胞毒性改变，胎儿体内产生的代谢产物如胆汁酸通过胎盘转运到母体的功能受到影响，而且母体血中呈高浓度胆汁酸状态，使得胆汁酸由母体进入胎儿体内，胎儿血液中的胆汁酸水平异常聚集升高，胆汁酸可以通过被动扩散和钠依赖载体主动转运进入胎儿细胞内，可能引起胎儿细胞毒性改变[12]。大量临床研究发现，ICP孕妇血液中胆汁酸水平愈高，胎儿窘迫发生率亦愈高。由此可见，胆汁酸对胎儿的不良影响是明显的。UDCA通过降低母体血的高胆汁酸水平，减少了胎盘滋养细胞的毒性改变，从而改善胎儿环境，延长胎龄。在本研究中，ICP治疗组的早产率和Apgar评分≤7，与正常对照组相比无差别，提示积极治疗可以改善ICP患者围生儿的预后。

本研究表明，UDCA治疗ICP后，能显著地降低ICP患者的高胆汁酸水平，其中CA、GCA、TCA、TLCA水平下降最为明显。

[1]Binder T，Salaj P，Zima T，et al.Randomized prospective comparative study of ursodeoxycholic acid and S-adenosyl-L-methionine in the treatment of intrahepatic cholestasis of pregnancy[J].J Perinat Med，2006，34(5):383.

[2]Tribe RM，DannAT，KenyonAP，et al.Longitudinal profiles of 15 serum bile acids in patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy[J].Am J Gastroenterol，2010，105(3):585.

[3]Ye L，Liu S，Wang M，et al.High-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of bile acid profiles in serum of women with intrahepatic cholestasis of pregnancy[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，860(1):10.

[4]刘春芳，丁敏，何俊，等.应用高效液相色谱法建立妊娠肝内胆汁淤积症的胆汁酸谱[J].中华检验医学杂志，2005，28(7):713.

[5]丁敏，叶炼，王猛，等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定血清中游离和结合型胆汁酸[J].分析化学，2007，35(10):1506.

[6]曹泽毅.中华妇产科学[M].第1版.北京:人民卫生出版社，1999:501.

[7]Mazzella G，Rizzo N，Azzaroli F，et al.Ursodeoxycholic acid administration in patients with cholestasis of pregnancy:effects on primary bile acids in babies and mothers[J].Hepatology，2001，33(3):504.

[8]贺晶，蔡淑萍.妊娠期肝内胆汁淤积症的诊治[J].中华围产医学杂志，2009，12(1):64.

[9]曾丽，邵勇.熊脱氧胆酸治疗妊娠期肝内胆汁淤积症的研究进展[J].中华妇产科杂志，2010，45(7):547.

[10]Brites D，Rodrigues CM，Oliveira N，et al.Correction of maternal serum bile acid profile during ursodeoxycholic acid therapy in cholestasis of pregnancy[J].J Hepatol，1998，28(1):91.

[11]Lucangioli SE，Castaño G，Contin MD，et al.Lithocholic acid as a biomarker of intrahepatic cholestasis of pregnancy during ursodeoxycholic acid treatment[J].Ann Clin Biochem，2009，46(Pt 1):44.

[12]Donovan JM，Jackson AA.Transbilayer movement of fully ionized taurine-conjugated bile salts depends upon bile salt concentration，hydrophobicity，and membrane cholesterol content[J].Biochemistry，1997，36(38):11444.