异烟肼和利福平联用致小鼠肝损伤实验模型的建立

杨淑艳，钟秀宏，王 爽，温 娜，赵丽微（吉林医药学院，吉林市 132013）

结核病又称痨病，近年来，在农村发病有上升的趋势。临床应用的抗结核药物异烟肼、利福平和利福霉素钠等均对肝有损害作用，是药物肝毒性临床监测的重点药物[1]。由于抗结核药物致肝损伤的病程在临床实践中难以观察，因此有必要建立抗结核药物致肝损伤的动物模型。目前国内外均已有关于抗结核药物诱导肝损伤动物模型的报道，但所用的实验方法和剂量各不相同，多选用大鼠[2，3]作为动物模型。本研究选用小鼠作为动物模型，因为小鼠也可用于各种药物的急、慢性毒理实验，且价格低廉，通过动态观察小鼠肝功能及其组织病理学变化，了解抗结核药物联用致小鼠肝损伤的程度，可为抗结核药物的预防研究提供有价值的动物模型。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BA300型数码生物显微镜（中国麦克奥迪实业集团有限公司）；ZMN-7803型全自动组织包埋机（常州市华利电子有限公司）；SelectraXL型全自动生化分析仪（荷兰威图仪器有限公司）；TD5A型台式低速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；AG135电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；772可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）。

1.2 试药

异烟肼片（山西太原药业有限公司，批号：090101，规格：每片50 mg）；利福平胶囊（沈阳红旗制药有限公司，批号：1001131，规格：每粒0.15 g）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（潍坊三维生物工程集团有限公司，批号：100401）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和考马斯亮蓝测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20100428）；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 动物

昆明种小鼠32只，♀♂各半，体重22～24 g，吉林大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（吉）2008-0005。

2 方法

2.1 药物的制备

取异烟肼和利福平直接溶于生理盐水中，各自制成浓度为0.75%的灌胃液。

2.2 建模

取小鼠适应性饲养1周后，随机分为对照组（生理盐水）和模型组（异烟肼+利福平，均为75 mg·kg－1·d－1），各16只，异烟肼和利福平选取剂量为人临床用剂量体重换算的5.5倍[3]，每日空腹灌胃给予相应药物1次，灌胃体积为20 mL·kg－1·d－1。实验第7天，随机处死对照组和模型组各8只小鼠，其余小鼠继续灌胃至实验第14天。末次灌胃后禁食不禁水16 h，摘眼球取血，剖腹取肝。

2.3 观察指标

2.3.1 血清生化指标。全自动生化分析仪检测各组小鼠实验第7、14天血清中ALT和AST活性。

2.3.2 肝病理学检查。取肝用10%福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红（HE）染色。光镜观察第7、14天小鼠肝病理组织学变化。

2.3.3 肝组织中MDA含量与SOD活性。取肝组织，制成匀浆，按试剂盒说明书检测第7、14天小鼠肝组织中MDA含量与SOD活性变化。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 血清中ALT和AST活性变化

与对照组比较，模型组小鼠第7、14天血清中ALT、AST活性明显增强（P＜0.05或P＜0.01）。与第7天比较，模型组小鼠第14天血清中AST活性明显增强（P＜0.05），结果见表1。

表1 不同时间各组小鼠ALT、AST活性比较（±s，n＝8）Tab 1 Comparison of the activities of ALT and AST between two groups at different tim（e±s，n＝8）

表1 不同时间各组小鼠ALT、AST活性比较（±s，n＝8）Tab 1 Comparison of the activities of ALT and AST between two groups at different tim（e±s，n＝8）

与对照组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与第7天比较：#P＜0.05vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the 7th day：#P＜0.05

组别对照组模型组第7天ALT/U·L－1 39.63±9.40 126.50±43.61＊＊AST/U·L－1 171.63±36.89 232.13±34.98＊第14天ALT/U·L－1 40.13±8.31 171.63±101.86＊＊AST/U·L－1 190.88±42.97 316.88±105.71＊#

3.2 肝病理学变化

光镜可见对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，仅个别小鼠肝细胞可见空泡变性；模型组第7天处死的小鼠肝细胞索排列较紊乱，肝细胞体积增大，胞质疏松，可见程度不等的细胞水肿，有少量的肝细胞坏死和炎细胞浸润；模型组第14天处死的小鼠肝细胞索排列紊乱，肝细胞发生坏死较严重，并伴有明显的炎细胞浸润，具体见图1。

图1 各组小鼠肝病理学变化光镜图（HE，×100）Fig 1 Hepatic pathology of mice in the different groups under the light microscop（eHE，×100）

3.3 肝组织中SOD和MDA活性变化

与对照组比较，模型组小鼠第14天肝组织中MDA含量明显增加，SOD活性明显降低（P＜0.01），结果见表2。

表2 各组小鼠肝组织中MDA、SOD活性比较（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of MDA content and SOD activity in liver between two group（s±s，n＝8）

表2 各组小鼠肝组织中MDA、SOD活性比较（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of MDA content and SOD activity in liver between two group（s±s，n＝8）

与对照组比较：＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01

组别对照组模型组第14天MDA/nmol·mg－1pro 0.91±0.19 1.12±0.11＊SOD/U·mg－1pro 118.27±9.41 92.56±9.10＊

4 讨论

肝损伤动物模型的诱导是进行防治肝损伤药物研究的前提。目前，有关急性肝损伤动物模型的诱导方法很多，主要有生物性、免疫性、化学性等方法。生物性方法要求实验条件高且费用昂贵，限制了其应用。免疫性方法是通过免疫方法造成肝损伤，主要用于通过免疫机制而抗肝损伤的药物研究。化学性方法则是通过化学性肝毒物质，如四氯化碳、氨基半乳糖、硫代乙酰胺、异烟肼等致肝损伤。应用四氯化碳诱导肝损伤动物模型，条件要求低，技术易于掌握，可靠性强，重复性好，目前研究抗肝损伤新药常采用四氯化碳诱导动物模型，但由于肝功能复杂和肝损害因素的多样性，任何一种实验模型都不能全面、准确地反映特定肝损伤的本质[4，5]。因此，建立特定有针对性的肝损伤动物模型非常必要。

异烟肼和利福平是临床上常用的一线抗结核药物，2药联用是目前结核病短程疗法的治疗方式，但其联用肝毒性明显增加[6]。为了减轻2药联用的毒副作用及为临床研究作参考，有必要有针对性地建立2药联用致肝损伤的动物模型。目前2药单用和联用致大鼠肝损伤模型较多，但由于各种动物对药物的敏感性不同，因此本研究采用异烟肼和利福平联用建立小鼠肝损伤模型，剂量均为75 mg·kg－1·d－1，造模时间14 d，通过观察和检测不同时间对肝损伤形态和功能的影响来研究肝损伤的程度。结果显示，异烟肼与利福平联用随时间的延长小鼠肝损伤加重。说明2药联用14 d后可成功建立肝损伤小鼠模型，成功率为100%，其机制可能与毒性代谢产物引起肝细胞脂质过氧化有关[7]，因此该模型建立方法可用于抗结核药物联用致小鼠肝损伤的防治研究。

[1] 王新华，何红梅，张延霞，等.黄芩苷对异烟肼和利福霉素钠肝损伤小鼠的保护作用研究[J].中国药房，2007，18（28）：2 175.

[2] Zha YF，Zhang GY，Li ZH，et al.Relevance research of artituberculosis on hepatic injury[J].Int J Respir，2006，26（10）：781.

[3] 杨慧媛，宋育林，许建明，等.异烟肼利福平合用致大鼠肝损伤的实验模型[J].安徽医科大学学报，2008，43（2）：185.

[4] 齐艳萍，李和平.急性肝损伤动物模型制备的概述[J].甘肃畜牧兽医，2008，38（2）：37.

[5] 王福根，孙静霞.肝损伤动物模型的建立和应用[J].中国药房，2006，17（9）：702.

[6] Yue J，Peng RX，Yang J，et al.CYP2E1 mediated isoniazid-induced hepatotoxicity in rats[J].Acta Pharmacol Sin，2004，25（5）：699.

[7] 杨淑艳，钟秀宏，沈 楠，等.抗痨药所致肝损伤的发生机制和防治研究进展[J].吉林医药学院学报，2010，31（3）：159.