国产克霉唑乳膏微生物限度检查方法研究及卫生状况评价

蒋受军，刘涛，朱斌#，韦涛，黄橘，刘常凯（.广西壮族自治区食品药品检验所，南宁市5300；.桂林医学院，桂林市 54004）

克霉唑具广谱抗真菌活性，对表皮癣菌、毛发癣菌、曲菌、着色真菌、隐球菌属和念珠菌属均有显著抑制作用。克霉唑乳膏为皮肤科及妇科用药类非处方药，用于体癣、股癣、手癣、足癣、花斑癣、头癣以及念珠菌性甲沟炎和念珠菌性外阴阴道炎，为外用制剂，是2005年版《中国药典》二部收载品种[1]。克霉唑对真菌有抑制作用，对这类具有抗菌活性的药品进行微生物限度检查时，应首先消除其抗菌活性，并通过试验验证抗菌活性的去除是否彻底，以保证检验结果的有效性。《中国药典》克霉唑乳膏标准正文中未收载微生物限度检查方法，现按照2005年版《中国药典》二部附录ⅪJ微生物限度检查法有关规定[1]，对克霉唑乳膏的微生物限度检查方法进行研究验证，并用建立的方法对全国各企业生产的克霉唑乳膏进行微生物限度考察，以对国内克霉唑乳膏产品的微生物污染状况进行分析评价。结果，所建立方法适用性好；国产克霉唑乳膏卫生状况良好。

1 仪器与材料

1.1 仪器

D-53电热恒温培养箱（德国Binder公司）；HHB11.600电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；HR1自动菌落计数仪（杭州讯数科技有限公司）；OLY生物显微镜（日本Olympus公司）；SG8酸度计（瑞士Mettler Toledo公司）；MLS-3780灭菌锅（日本Sanyo公司）；无菌检查薄膜过滤器（浙江宁海白石药检仪器厂）；生物安全柜（新加坡Esco公司）。

1.2 培养基和试剂

营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、0.7%蛋白胨水、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴代十六烷三甲铵琼脂培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基均为北京三药科技开发公司产品。

1.3 菌种

大肠埃希菌[CMCC（B）44 102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、黑曲霉[CMCC（F）98 003]均由中国医学微生物菌种保藏管理中心提供。

1.4 药品

克霉唑乳膏：来源于广东顺峰药业有限公司、浙江盛基药业有限公司、天津药业集团新郑股份有限公司、芜湖三益制药有限公司、广州白云山制药股份有限公司白云山何济公制药厂（以下简称何济公制药厂）等国内生产企业共276批样品，规格有1%、3%2种，具体情况详见表1（批号略）。

表1 样品来源、规格及批次Tab 1 Source，specification and batch number of samples

2 方法与结果

参照2005年版《中国药典》微生物限度检查法试验[1]。

2.1 菌液的制备

接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24 h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48 h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，23～28℃培养5～7 d，加入3～5 mL 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱；吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含孢子数为50～100 cfu的孢子悬液。

2.2 供试液的制备

取样品10 g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液70 mL，混匀，加30 mL无菌吐温-80，混匀，加入30 mL十四烷酸异丙酯萃取，取下层作为1∶10的供试液。

2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数检查方法的建立及验证

2.3.1 计数检查方法。①培养基稀释法：取不同量供试液（1∶10）注皿，每皿分别加入1 mL验证菌菌液，注入15～20 mL不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，摇匀，凝固，培养。如每皿注入0.5 mL，则为1∶20稀释。

②薄膜过滤法：取1∶10供试液1 mL，加入100 mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，采用薄膜过滤法处理，0.9%无菌氯化钠溶液300 mL冲洗（每膜）。

2.3.2 敏感菌株及方法筛选。选取1批克霉唑乳膏按培养基稀释法进行试验，进行验证敏感菌株初步筛选。培养基稀释法（每皿0.5 mL）、薄膜过滤法加菌回收率试验结果见表2。

表2 2种方法回收率试验结果Tab 2 Results of 2 kinds of recovery tests

采用培养基稀释法（每皿0.5 mL），结果3株细菌验证菌回收率均达到要求（大于70%）；白色念珠菌回收率为0，黑曲霉大于70%。由此表明：①克霉唑对白色念珠菌有很强的抑制作用，为5种验证菌中对克霉唑最敏感菌株，方法筛选可采用该菌株进行；②培养基稀释法即可消除克霉唑对细菌的抑制作用，初步确定细菌计数可采用培养基稀释法（每皿0.5 mL）；③以白色念珠菌为试验菌，对薄膜过滤法进行初步验证，结果回收率为97%，表明薄膜过滤法可消除克霉唑对白色念珠菌的抑制作用，初步确定霉菌和酵母菌计数可采用薄膜过滤法进行。

2.3.3 方法验证。以金黄色葡萄球菌、白色念珠菌为验证菌，选取国内13家生产企业的各1批克霉唑乳膏为样品，对初步确定的细菌、霉菌和酵母菌计数测定方法进行验证，结果见表3。

表3 13家生产企业产品计数方法验证结果Tab 3 Validation result of determination method for products from 13 manufacturers

表3结果表明，13个不同厂家样品，细菌代表菌株金黄色葡萄球菌采用培养基稀释法（每皿0.5 mL），回收率均大于70%；霉菌和酵母菌代表菌株白色念珠菌采用薄膜过滤法，回收率均大于70%。因此，克霉唑乳膏细菌计数方法采用培养基稀释法（每皿0.5 mL），霉菌和酵母菌计数方法采用薄膜过滤法（冲洗量每膜300 mL）可满足要求。

2.4 控制菌检查方法的建立及验证

（1）常规法：分别取1∶10的供试液10 mL，加入100 mL营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基中，分别加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌10～100 cfu，35℃培养24～48 h。取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板，35℃培养24～48 h，观察其菌落形态。

（2）培养基稀释法：培养基用量为300 mL，其他同常规法。

另取大肠埃希菌作为阴性对照试验菌。控制菌验证试验结果见表4（表中“/”表示未做）。

表4 控制菌验证试验结果Tab 4 Validation result of determination method for pathogenic bacteria

表4结果表明，采用常规法（培养基用量100 mL）进行铜绿假单胞菌检查方法成立。克霉唑乳膏对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用，需采用培养基稀释法（培养基用量300 mL）进行。

2.5 样品微生物限度检查

根据验证结果，确定细菌计数采用培养基稀释法（每皿0.5 mL），霉菌和酵母菌计数采用薄膜过滤法（冲洗量300 mL），金黄色葡萄球菌采用培养基稀释法（培养基用量300 mL），铜绿假单胞菌采用常规法（培养基用量100 mL），对276批国产克霉唑乳膏进行微生物限度检查，结果见表5。

表5 276批样品微生物限度检查结果Tab 5 Results of microbial limit test of 276 batches of samples

由表5可见，对276批克霉唑乳膏进行微生物限度检查，结果合格率99.3%；有2批样品不合格，均为细菌计数不合格。

3 讨论

3.1 供试液处理

对于部分乳膏、栓剂等非水溶性供试品，需采用吐温、十四烷酸异丙酯等进行乳化、萃取前处理，以分离乳膏基质和药用成分，提取污染菌，供试液制备过程相对复杂[2，3]。克霉唑乳膏基质对供试品前处理影响较大，在制备供试液过程中，采用了吐温-80作为表面活性剂、十四烷酸异丙酯对样品进行萃取以分离基质和药用成分、提取污染菌。由于各厂家处方、工艺的差异，不同厂家产品处理过程中，乳膏基质的除去难易不等，一些样品较容易实现分离提取，一些样品则需要加热才能有效溶解萃取；在进行薄膜过滤时，一些样品提取液仍堵塞滤膜，需减少每膜上样量或进行多次提取。

3.2 标准的建立设想

经对不同厂家的克霉唑乳膏检查方法进行验证，表明细菌计数采用培养基稀释法（每皿0.5 mL）、霉菌和酵母菌计数采用薄膜过滤法（冲洗量每膜300 mL）、控制菌金黄色葡萄球菌采用培养基稀释法（培养基用量300 mL）、铜绿假单胞菌采用常规法（培养基用量300 mL）检验均能满足2005年版《中国药典》对微生物限度检查方法的要求。由于克霉唑乳膏具有抗菌作用，其微生物限度检验方法如果不收入各论，则不同实验室进行该品种均要对方法进行研究，易造成各实验室检验方法的差异以及不必要的重复工作。此次研究所建立的方法经过国内各厂家产品的验证，具有良好的通用性，建议考虑收入克霉唑乳膏标准正文。

3.3 克霉唑乳膏微生物限度检查结果分析

3.3.1 整体情况。采用建立的微生物限度检验方法对抽验的276批样品进行检验，结果2批样品不合格，均为细菌计数超过规定限度，不合格率为0.7%。

3.3.2 样品的真菌污染。虽然克霉唑乳膏为抗真菌药，但样品检验结果显示，部分样品存在不同程度的真菌污染，其中一些样品真菌污染较为严重，测定结果接近限度规定。样品中检出的真菌类型基本为霉菌，从形态上分析主要有青霉、根霉、毛霉等。提示虽然克霉唑具广谱抗真菌活性，但也不可能杀灭所有真菌，对一些真菌没有杀菌作用或者仅为暂时的抑制作用，如果生产过程各个环节不严格控制，都会造成产品的真菌污染。克霉唑乳膏为治疗真菌感染的外用药，如果产品本身即存在较严重的真菌污染，给用药者会带来二次感染的风险。

3.3.3 样品的细菌感染。部分克霉唑乳膏存在细菌污染，细菌数标准规定限度为不得超过1 000个/g[1]，而有2批不合格样品细菌数分别为1 100 000、820 000个/g，严重超标。

对2批不合格样品的检出菌进行分离鉴定，结果显示，2个样品均为单一菌污染。分离得到的菌株分别采用涂片镜检、生化鉴定、分子生物学基因分型分析。结果，上述2批样品污染菌均为洋葱霍尔德菌。该菌为呼吸系统疾病的致病菌，感染性强、危害风险较大。2批不合格样品为同一厂家产品，检出菌鉴定显示2批产品为相同微生物污染，提示该企业生产环节可能存在系统的污染来源。

3.3.4 严格控制微生物污染。由于克霉唑乳膏基质相对较适合微生物存活，且效期较长，在产品生产过程中带入的微生物污染，在产品贮存、流通过程中，如果有适宜条件，一些特定微生物可能会大量繁殖，给用药者带来危害。因此，必须严格控制产品的微生物污染。

[1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：236、附录93-98.

[2] 王 进.环吡酮胺阴道栓微生物限度检查方法研究[J].中国药房，2008，19（28）：2 216.

[3] 卢文斌，郭瑜蓉.硝酸咪康唑乳膏微生物限度检查方法学验证[J].海峡药学，2009，21（9）：48.