PTEN siRNA对多发性骨髓瘤细胞周期和侵袭力的影响及其分子机制

王素云 潘 崚 郝洪岭 王 超 李 燕 杨 洁 王瑞仓 李 杰 袁 军

(河北省人民医院血液内科，河北 石家庄 050000)

癌基因和抑癌基因表达调控失常均可引起细胞增殖失控导致肿瘤发生。PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten)基因及其蛋白表达异常与一些恶性肿瘤的发生发展、肿瘤细胞的生物学行为和肿瘤的预后关系密切，其在包括多种恶性血液病在内的多种恶性肿瘤单个核细胞株和原发肿瘤中出现高突变率和功能缺失〔1～4〕。多发性骨髓瘤(MM)目前尚无治愈方法。遗传学改变被认为是MM发病的重要致病因素，抑癌基因缺失是重要的遗传学变化。目前，在多个骨髓瘤细胞株及骨髓瘤患者中已经发现该基因存在不同程度突变或大片段缺失〔5～7〕，从而导致PTEN基因及蛋白表达缺失，丧失其抑癌基因活性。前期研究发现转染野生型PTEN基因后能明显抑制骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞增殖及凋亡〔8〕。由于RPMI 8226中存在一定程度PTEN mRNA及蛋白表达〔8〕，本研究通过导入PTEN siRNA，封闭PTEN基因及蛋白表达，探讨其对骨髓瘤RPMI8226细胞增殖、凋亡及侵袭的研究及其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 引物、逆转录反应体系(北京赛百盛);SYBR Green Real Master Mix(北京天根);PTEN、FAK、p－FAK(Tyr397)、MMP－9、MMP－2、Survivin、β－actin 鼠抗人单克隆抗体(Santa Cruz)、HRP标记的山羊抗鼠二抗(北京鼎国)，Caspase－Glo 3/7 活性检测试剂盒，PTEN siRNA、NS－siRNA(上海吉玛生物工程公司)，Lipofectamine 2000TM(Invitrogen公司)，PTEN siRNA 序列 5′－AAC CCA CCA CAG CUA GAA Ctt－3′;5′－AAG UUC UAG CUG UGG UGG Gtt －3′。对照 siRNA 序列 5′－ UUC UCC GAA CGU GUC ACG Utt －3′;5′－ACG UGA CAC GUU CGG AGA A tt －3′。

1.1.2 细胞系 RPMI8226细胞用含15%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，细胞系均为本实验室长期保存细胞系。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染 将1×105细胞接种到6孔板，37℃、5%CO2条件下培养24 h，待细胞贴壁生长至70%密度时进行转染。按每孔取 50 μmol/L 的 siRNA 储液 2 μl，溶于 100 μl无血清、无抗生素、无核酶的RPMI1640培养液中，混匀。按每孔Lipofectamine 2000TM5 μl，溶于 100 μl无血清、无抗生素、无核酶的RPMI1640培养液中，混匀，室温静置5 min。混合后，室温静置20 min。弃去6孔板中的培养液，用无血清RPMI1640培养液洗涤细胞两次，每孔换新鲜的上述培养液1.8 ml，再将上述的混合液加入每孔细胞中，混匀后置培养箱中，37℃培养。转染后6 h，更换为含10%FBS的无抗生素、无核酶的 RPMI1640培养液，细胞用于后续实验。

1.2.2 细胞生长曲线(MTT法) 采用96孔板，取对数生长期RPMI8226细胞每孔接种5000个，每组3个复孔，每孔体积100 μl。分为未转染组(对照组)、NS－siRNA 组(转染 NS－siRNA)和 PTEN－siRNA 组(转染 PTEN－siRNA)，转染细胞。于培养后 0、1、2、3、4、5、7 d，不同时间点每孔加入噻唑兰(MTT)溶液(5 mg/ml)10 μl，37℃孵育4 h后离心弃培养液，另加入二甲基亚砜(DMSO)100 μl振荡15 min，酶标仪检测每孔OD 540值。以吸光度值A值为纵坐标，时间(d)为横坐标绘制生长曲线。计算生存率，公式:生存率=转染PTEN－siRNA组A值/转染NS－siRNA组A值×100%。实验重复3次。

1.2.3 细胞周期检测 收集转染不同时间的细胞，每组收集1×106个，70%乙醇4℃固定过夜;加入RNA酶，室温30 min后加入碘化丙啶(PI)，4℃存放15 min以上，流式细胞仪检测，分析凋亡率及各细胞周期比例。

1.2.4 实时荧光定量PCR ①收集不同组RPMI8226细胞，TRIzol提取细胞总RNA，电泳鉴定RNA并定量，逆转录合成cDNA。②实时荧光定量PCR反应:SYBR反应体系共25 μl。反应条件为 94℃ 5 min，94℃ 45 s，60℃ 1 min，30 个循环，设空白对照。PCR反应前3～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，调节基线至适宜处，各荧光曲线与基线交叉点的循环数即为 Ct值。根据 C(t)=C(t)GENE－C(t)β－actin，C(t)=2－C(t)计算检测基因mRNA相对表达量，每组重复3次取平均值。所检测的基因及相关PCR引物序列见表1。

表1 FQPCR扩增引物序列

1.2.5 Western印迹检测PTEN、FAK、p－FAK蛋白表达 收集不同标本细胞，每样本107细胞，加入200 μl预冷的蛋白裂解液4℃裂解1 h，冰浴下超声裂解15 min。12000 r/min 4℃离心20 min，取上清用考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白浓度，分装后置－20℃保存。取80 μg样品蛋白质加入等体积上样缓冲液，经5%浓缩胶和10%SDS－PAGE凝胶电泳后，用水浴式电转仪转至硝酸纤维素膜上。经5%BSA 37℃封闭1 h，分别加入小鼠抗人单克隆抗体，4℃孵育过夜。TBS漂洗5 min×3次，加入山羊抗小鼠HRP标记二抗，37℃孵育1 h，TBS漂洗5 min×3次，化学发光法检测后分析结果。

1.2.6 Transwell小室细胞侵袭实验 将50 mg/L的Matrigel 4℃融化，用无血清 RPMI1640培养基将其 1∶8稀释混匀。200 μl包被Transwell小室聚碳酸脂膜上室面，4℃风干。不同转染组细胞加入无血清培养基孵育12 h。取105细胞加入800 μl无血清培养基中，加入0.1%的BSA维持渗透压，放入Transwell小室上层。下室加入含10%FBS的RPMI1640培养基1000 μl，孵育24 h。取出Transwell小室，用下室培养液反复淋洗下室底面，用棉签擦去多聚碳酸盐膜上层细胞，立刻在倒置荧光显微镜下观察黏附在小室下层有荧光细胞的数量，400倍显微镜下计数10个视野取平均值。将脱落及淋洗下来的细胞在倒置显微镜下计数有荧光细胞数量后MTT间接计数。整个操作过程在冰上及无菌条件下进行并重复试验3次。

1.2.7 Caspase－3/7活性检测 将不同转染组细胞(5000个)/100 μl，加于96孔板中，每组3 个复孔，将 Caspase－Glo 3/7或9底物和缓冲液混合，取100 μl加入上述标本中，混合孵育4 h后酶标仪测波长405 nm处的吸光值，空白孔作参照，计算处理组吸光度与对照组吸光度的比值，确定活化程度。1.3 统计学处理 采用SAS8.0统计软件，两样本均数比较应用t检验，多样本均数比较应用方差分析，率的比较应用χ2检验。

2 结果

2.1 PTEN－siRNA转染 RPMI8226细胞的效果 RT－PCR和Western印迹分析结果显示，与转染无关序列即对照NS－siRNA的细胞相比，PTEN－siRNA导入可降低PTEN表达80%以上。实时荧光定量PCR结果显示在应用PTEN－siRNA转染RPMI 8226细胞48 h时，PTEN mRNA表达水平达到最低。转染后48 h，PTEN mRNA表达水平在 NS－siRNA转染组为 1.107±0.306，PTEN－siRNA转染组为0.143±0.045，二组相比有显著性差异(P＜0.01)。Western印迹法检测PTEN蛋白表达水平的结果显示:应用 PTEN－siRNA转染 RPMI8226细胞48 h时，PTEN蛋白表达水平达到最低。转染后48 h，NS－siRNA转染组PTEN蛋白表达水平为0.699±0.130，PTEN－siRNA转染组为0.089±0.025，二者相比差异显著(P＜0.01)。

2.2 MTT实验检测RPMI8226细胞生长曲线 RPMI8226细胞转染PTEN－siRNA后第1～6天出现差异，4 d以后细胞生长逐渐降低，在第4天细胞生存率最大，为(141.55±8.34)%，NS－siRNA转染组和PTEN－siRNA转染组OD 490值比较有显著差异(P＜0.01)。

2.3 流式细胞学检测细胞周期变化 PTEN－siRNA转染RPMI 8226细胞后，分别于0、24、48、72 h收集各组细胞，流式细胞仪检测细胞周期变化，并根据细胞周期图亚二倍体凋亡峰分析细胞凋亡率。细胞周期分析显示PTEN－siRNA转染RPMI8226细胞48 h后，G0/G1期细胞比例升高，G2/M期和S期细胞比例降低。凋亡峰显示细胞凋亡减少。见图1。

图1 PTEN-siRNA转染RPMI8226细胞后不同时间细胞周期分布

2.4 PTEN－siRNA对人MM细胞株RPMI8226细胞侵袭的影响 未转染组、NS－siRNA和PTEN－siRNA黏附于下室面的细胞数量分别为:49.33±7.63、47.17±7.76和 79.50±11.89，NS－siRNA和PTEN－siRNA二组相比差异显著(P＜0.01)。

2.5 转染 PTEN－siRNA 对 RPMI8226细胞 Survivin、Caspase－3、Caspase－7、FAK、MMP－2 和 MMP－9 mRNA 的影响 转染 PTEN siRNA后随着PTEN mRNA表达的减低，凋亡相关基因Survivin mRNA表达水平增加，Caspase－3/－7 mRNA及蛋白活性表达水平减低，FAK mRNA MMP－2/－9 mRNA 表达水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。见表2。

2.6 转染 PTEN－siRNA转染对 RPMI8226细胞 FAK、p－FAK、MMP－2 和 MMP－9 蛋白及 Caspase－3/－7 及蛋白活性表达的影响

转染PTEN siRNA后随着PTEN mRNA表达的减低，凋亡相关蛋白Survivin表达水平增加，Caspase－3/－7及蛋白活性表达水平减低。FAK、P－FAK、MMP－2/－9 蛋白表达水平升高。见图 2，表3。

表2 转染48 h后 Survivin、Caspase-3、-7、PTEN、FAK、MMP-2、MMP-9 mRNA 表达情况(± s，n=3)

表2 转染48 h后 Survivin、Caspase-3、-7、PTEN、FAK、MMP-2、MMP-9 mRNA 表达情况(± s，n=3)

与 PTEN－siRNA 组比较:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

e－7 mRNA FAK mRNA MMP－2 mRNA MMP－9 mRNA未转染组 1.049±0.2482) 1.013±0.2072) 1.008±0.1982) 1.015±0.1962) 0.979±0.3081) 1.002±0.2132) 1.086±0.2191)组别 PTEN mRNA survivin mRNA Caspase－3 mRNA Caspas NS－siRNA组 1.107±0.3062) 1.008±0.1912) 0.979±0.1742) 1.003±0.2042) 0.940±0.3012) 0.998±0.2062) 1.029±0.2801)PTEN－siRNA组 0.143±0.045 2.534±0.059 0.473±0.069 0.510±0.033 2.176±0.612 2.793±0.740 1.980±0.733

表3 转染RPMI8226细胞PTEN-siRNA不同时间后Caspase3/7蛋白活性变化( ± s，n=3)

表3 转染RPMI8226细胞PTEN-siRNA不同时间后Caspase3/7蛋白活性变化( ± s，n=3)

与0 h组比较:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;与 PTEN－siRNA组比较:3)P ＜0.01，4)P ＜0.05

0 h 24 h 48 h 72 h未转染组 0.314±0.029 0.348±0.0383) 0.357±0.0334) 0.370±0.0344)组别NS－siRNA 组 0.314±0.029 0.347±0.0363) 0.360±0.0344) 0.369±0.0384)PTEN－siRNA组 0.314±0.029 0.230±0.0261) 0.115±0.0182) 0.073±0.0082)

图2 PTEN、FAK、P-FAK、MMP-2、-9蛋白表达水平差异

3 讨论

PTEN表达异常与多种血液系统恶性肿瘤密切相关〔2，3〕，幼年型粒单核细胞白血病(JMML)病人常见PTEN缺失〔4〕，提示PTEN在调节造血细胞增殖、凋亡、恶性转化中的作用。目前，在多个骨髓瘤细胞株及骨髓瘤患者中已经发现有该基因的突变或大片段缺失。Chang等〔7〕研究发现71例原发性MM患者有4例(5.6%)存在PTEN基因片段缺失，4例患者均为Durie－Salmon分期Ⅲ期。10例原发性浆细胞白血病患者中2例(20%)、10种人 MM 细胞株(HMCLs)中 OCI－My6和 U266(20%)发现有PTEN杂合性缺失。PTEN缺失多存在于MM进展期，并且在浆细胞白血病和人骨髓瘤细胞株中发生率明显升高，这表明PTEN缺失可能与MM疾病进展有关。

先前实验我们以腺病毒作为载体将野生型PTEN基因转染RPMI8226细胞和原代MM细胞，结果显示PTEN基因高表达可以抑制RPMI8226细胞以及MM原代细胞增殖，并促进细胞凋亡，使细胞周期阻滞于G2/M期，抑制细胞侵袭活性，使细胞侵袭能力降低。其分子机制可能与PTEN抑制FAK/MMP信号通路，下调 FAK、p－FAK 及 MMP－2，－9 的表达有关〔8〕。由于在 MM细胞株RPMI8226中，存在一定程度的PTEN mRNA和蛋白表达〔9，10〕，本研究结果表明抑制PTEN表达能够促进细胞增殖。RPMI8226细胞存在自发凋亡的现象，转染PTEN－siRNA后导致PTEN基因及蛋白表达的减低，细胞失去了PTEN的抑制，RPMI 8226细胞凋亡明显减少，从而导致细胞生存率明显增高。进一步检测凋亡相关基因发现，PTEN－siRNA作用于RPMI8226细胞后，细胞 Survivin 表达上调和 Caspase－3，Caspase－3－7 表达受抑，细胞凋亡减少。细胞侵袭实验结果显示，PTEN－siRNA转染使RPMI8226细胞的侵袭力增加。这与先前研究结果:PTEN基因转染RPMI8226细胞使之高表达PTEN基因得到的结论互相一致〔8〕，进一步检测发现，FAK、p－FAK、MMP－2 和 MMP－9 表达水平明显升高，从而说明PTEN基因能够降低MM RPMI8226细胞的侵袭活性，并且通过基因和蛋白表达的变化，调节细胞内FAK磷酸化水平，进一步调节MMP的表达，从而影响细胞的迁移和侵袭能力，为进一步研究PTEN在骨髓瘤中的分子机制奠定了基础，同时为PTEN基因治疗骨髓瘤提供了理论依据。

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