贲门癌组织中人乳头瘤病毒感染状况的检测

张 科 杨寓玲 慈雅丽 王新燕 李淑英 (华北煤炭医学院，河北 唐山 063000)

人乳头瘤病毒(HPV)属小DNA病毒，与许多部位鳞状上皮细胞良性及恶性肿瘤性病变有关，其中HPV感染与宫颈癌的相关性已得到公认。近年来研究显示，贲门癌的发生与HPV感染有关，但贲门癌发生与HPV的病原学意义尚未被公认。为探讨人乳头瘤病毒与贲门癌发生的相关性，本研究应用PCR法，并使用HPV L1基因区通用引物、HPV16型和18型别E6基因特异性引物对河北省保定市贲门癌组织进行HPV检测。

1 材料与方法

1.1 材料 河北省保定市贲门癌组织标本50例(其中，新鲜手术切除组织标本18例，组织切除后经甲醛溶液浸泡标本32例)，男性35例，女性15例，平均年龄为57(33～78)岁。新鲜手术切除组织标本立即放入－70℃冰箱保存;经甲醛溶液浸泡标本用无菌PBS冲洗后放入－70℃冰箱保存。研究中阳性对照HPV16为宫颈癌标本DNA;HPV18为Hela细胞DNA。

1.2 组织块中全核酸的提取 使用北京百泰克生物计划有限公司DNA提取实际盒，按说明书指示，贲门癌组织标本经液氮冷冻研磨后，提取组织全核酸后于－20℃保存。

1.3 HPV的PCR检测 使用β-Actin作内参(PCR产物为292 bp)，使用 HPV L1区 GP5+/6+引物、HPV16E6和HPV18E6 型 特 异 性 引 物 进 行 PCR 扩 增。β-actin〔1〕、HPV GP5+/6+以及HPV16E6和HPV18E6型特异性引物的扩增条件〔2〕。PCR 中使用了 Ex-Taq，每个反应总体积为 25 μl，加入1 μl提取的组织全核酸作为模板。本研究使用的引物及扩增产物的长度见表1。

表1 本研究中使用的扩增引物

2 结果

2.1 标本全核酸的提取和质量控制 从图1和图2可以明显看出代表人全核酸的条带:新鲜手术切除组织标本的全核酸在大约20 kb处有明显的泳动条带，而人类基因组核酸DNA泳动条带约为20 kb，因此可判定所提DNA为人因组核酸DNA，并且DNA浓度比较均一;甲醛溶液浸泡标本DNA提取后，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下进行观察，约在500～1 500 bp处有泳动条带，出现这种现象的原因可能是标本经甲醛溶液浸泡后，使得标本中的DNA发生了断裂，因而出现较小断裂片段。用β-actin作内参检测所提取DNA的质量。图1和图2中，以293细胞提取全核酸为模板的阳性对照，其产物大小为292 bp，提取的贲门癌组织全核酸为模板的PCR产物大小与阳性对照相近，说明组织中所提全核酸可满足进一步实验要求。

2.2 标本HPV检测 对50例贲门癌样品进行了PCR检测，用含有HPV16的宫颈癌标本DNA及含有HPV18的Hela细胞DNA作为本组实验阳性对照，可观察到约150 bp的GP5+/6+扩增产物(图1和图2)。与之参照，50例贲门癌样品中，检测到43例HPV阳性，HPV阳性率为86.0%;其中18例新鲜组织中，检测到16例HPV阳性，HPV阳性率为88.9%;32例甲醛溶液浸泡组织中，检测到27例 HPV阳性，HPV阳性率为84.4%，新鲜组织中HPV检出率略高于甲醛溶液浸泡组织中HPV检出率，其原因可能是甲醛溶液浸泡组织中DNA发生了断裂所致。

从图1和2可以看出，50例贲门癌样品中，其中26例检测到HPV16 E6基因，阳性率为52.0%，12例为HPV18 E6基因阳性，阳性率为24.0%，8例HPV16E6和18E6基因均阳性，为混合感染;50例样品中，18例新鲜样品中检测到11例HPV16 E6基因，阳性率为61.1%，5例为HPV18 E6基因阳性，阳性率为27.8%，3例HPV16E6和18E6基因均阳性，为两型混合感染，HPV16和HPV18总感染率为72.2%。32例甲醛溶液浸泡样品中检测到15例HPV16 E6基因，阳性率为47.9%，7例为HPV18 E6基因阳性，阳性率为21.9%，5例HPV16E6和18E6基因均阳性，为两型混合感染，HPV16和HPV18总感染率为53.1%。将HPV检测结果总结在表2。图1和图2可见，HPV，特别是HPV16和18两型别在河北省保定市贲门癌样品中占有较高的分布频率。

图1 18例贲门癌新鲜样品中HPV检测结果

图中:1A，1～18是新鲜组织;2A，1～32是甲醛溶液浸泡组织中提取的DNA;1B(2B)中，293是293细胞系DNA为模板的阳性对照，1～18(1～32)为 β-actin内参扩增;1C和2C，293为293细胞系DNA为模板的阴性对照，HPV16和HPV18分别是以含有HPV16的宫颈癌标本DNA及含有HPV18的Hela细胞DNA为模板的阳性对照，1～8(1～32)为GP5+/6+的扩增;1D和2D中，293为293细胞系DNA为模板的阴性对照，HPV16是含有HPV16的宫颈癌标本DNA为模板的阳性对照，HPV18是以含有HPV18的Hela细胞DNA为模板的HPV16型特异性对照，1～18(1～32)为HPV16E6的扩增;293为293细胞系DNA为模板的阴性对照，HPV18是以含有HPV18的Hela细胞DNA为模板的阳性对照，HPV16是以含有HPV16的宫颈癌标本DNA为模板的HPV18型特异性对照，1～18(1～32)为HPV18E6扩增;图1和图2中M为宝生物M为λEcoT14 I，M1为100 bp DNA Ladder，Neg，为以无菌双蒸水位模板的阴性对照。

图2 32例贲门癌经甲醛溶液浸泡样品中HPV检测结果

表2 河北省保定市贲门癌样品中HPV DNA检测结果

3 讨论

贲门癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发生和发展涉及多种因素。贲门癌发生与HPV感染有关。

HPV是一种常见的双链DNA病毒，基因组约为8 000 bp，迄今为止已经鉴定分离了100多种基因型。所有HPV均是严格的嗜上皮型病毒，分别感染鳞状上皮与黏膜细胞。根据HPV致瘤能力的高低分为高危型，如常见的16型与18型;低危型，如常见的6型，11型等。高危型HPV感染常见于宫颈癌中，而低危型感染多与宫颈良性乳头瘤病变及尖锐湿疣的发生相关〔3～5〕。

徐卫国等〔6〕报道贲门癌中HPV检出率为67.6%，食管癌中HPV检出率为70%，二者的检出率之间无显著性差异。过去，在林州市食管癌切除组织样品中，检测出HPV16 E6基因和HPV18 E6基因，其阳性率分别为61.3%和25.8%;在广东潮汕地区食管癌组织中HPV存在比率达到60%，同时，食管癌HPV16阳性细胞中，HPV DNA在宿主染色体上整合率较高;建立了30多年的食管癌EC109细胞株仍有HPV18型DNA存在;HPV E6E7基因导入能诱发食管上皮细胞永生化和癌变〔7〕。上述证据表明，HPV在食管癌发生中起一定的病因学作用，由此推测贲门癌的发生可能与HPV感染有关。

1 Lee DC，Cheung CY，Law AH，et al.p38 mitogen-activated protein kinase-dependent hyperinduction of tumor necrosis factor alpha expression in response to Avian influenza virus H5N1〔J〕.J Virol，2005;79:10147-54.

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5 Allen AL，Siegfried EC.What’s new in human papillomavirus infection〔J〕.Curr Opin Pediatr，2000;12(4):365-9.

6 徐卫国，张力建，陆哲明，等.沈上消化道癌组织中人乳头瘤病毒16及E6mRNA检测的临床意义〔J〕.中华医学杂志，2003;83(21):1910-4.

7 沈忠英，岑 山，蔡维佳，等.人乳头状瘤病毒18型E6E7基因诱导人胚食管上皮永生化〔J〕.中华实验和临床病毒学杂志，1999;13(2):121-3.