不稳定型心绞痛患者MCP-1-2518G/A多态性和血清单核细胞趋化蛋白水平的相关性

何国平 姜 九 师干伟 许联红 戚传平 (江苏大学附属武进医院心血管内科，江苏 常州 23002)

不稳定型心绞痛(UAP)是严重危害人类健康的主要疾病之一，炎症反应在其发病过程中发挥重要作用〔1〕。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)能诱导斑块内细胞表达某些炎症因子、基质金属蛋白酶和组织因子等使原来稳定的斑块变成易损斑块并发生破裂和继发血栓形成而导致急性冠脉综合征(ACS)的发生〔2〕。流行病学研究表明，血清MCP-1水平与ACS密切相关，且血清MCP-1水平明显升高的ACS患者预后差〔3，4〕。弗明翰心脏病中心的研究〔5〕表明，MCP-1-2518位点携带G等位基因者血清MCP-1水平显著增高，且增加AMI的易感性。但MCP-1-2518G/A多态性对不同种族人群血清MCP-1水平和心肌梗死的影响并不一致〔6，7〕。本研究旨在探索中国苏南地区汉族人群的MCP-1-2518G/A多态性、血清MCP-1水平和UAP三者之间的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 所有研究对象均为2005年6月至2010年6月期间在江苏大学附属武进医院心内科的住院病人。(1)MCP-1-2518G/A多态性检测对象:UAP组:符合2002年AHA/ACC关于ACS诊断标准的UAP患者(UAP组)203例，男139例，女64例，年龄 36～87〔平均(64.82±11.09)〕岁;同期住院并经冠脉造影检查证实无冠脉病变者(对照组)192例，男95例，女97例，年龄30～76〔平均(56.93±10.12)〕岁。(2)血清MCP-1水平检测对象:从以上研究对象中随机选择UAP患者(UAP组)72例，男50例，女22例，年龄36～85〔平均(63.74±10.67)〕岁;无冠脉病变者(对照组)73例，男38例，女35例，年龄30～76〔平均(59.04±12.13)〕岁。所有研究对象排除严重肝肾功能不全、肿瘤、风湿类疾病和急性或严重慢性感染者。该研究经本院医学伦理委员会批准，并征得所有入选对象知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料采集 收集所有入选对象的基本资料，包括年龄、性别、吸烟史、高血压史、糖尿病史、血脂和冠状动脉造影等结果。

1.2.2 MCP-1-2518G/A多态性检测 采集静脉血2 ml，采用标准的酚-氯仿法提取外周白细胞基因组DNA，置于－70℃冰箱保存备用。采用PCR-RFLP方法检测MCP-1-2518位点基因型。上游引物:5'-TCT CTC ACG CCA GCA CTG ACC-3'，下游引物:5'-GAG TGT TCA CAT AGG CTT CTG-3'(引物由大连宝生物公司合成)。扩增条件:95℃预变性5 min，然后以95℃40 s、60℃ 30 s和72℃ 40 s共行30个循环，最后 72℃延伸10 min;扩增结束后，取4 μl PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳10 min，确定PCR产物为所需要的目的片段(234 bp)。对目的片段行限制性酶切:(1)酶切反应体系:PCR产物10 μl、PvuⅡ内切酶1 μl(由大连宝生物公司提供)、缓冲液2 μl和去离子水7 μl;(2)酶切反应条件:37℃水浴过夜;(3)基因分型:取酶切产物10 μl加6 ×loading 1.5 μl，在含胶红染料的 2%琼脂糖凝胶中电泳30 min，然后在紫外线凝胶成像仪中观察结果并分析。

1.2.3 血清MCP-1水平测定 取入选者静脉血2 ml，室温下静置0.5～1 h，离心后留取上层血清，－70℃冰箱保存待测。采用ELISA法随机检测了72例UAP患者和73例对照者的血清MCP-1含量。试剂盒购自ADL公司，操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.4 血脂测定 在自动生化分析仪上检测血清甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。数值变量以±s表示;分类变量以百分比(%)表示。血清MCP-1水平在组内基因型间比较采用单因素方差分析、基因型间两两比较采用LSD检验，其他数值变量组间比较采用t检验;分类变量组间比较采用χ2检验。相关性分析采用多元线性回归分析。MCP-1-2518位点基因型及血清MCP-1水平与UAP发病风险相关性分析采用多变量Logistic回归分析。

2 结果

2.1 UAP组与对照组的临床资料比较 与对照组相比，UAP组中高血压，糖尿病及吸烟者所占比例及血清TG、TC和LDL-C水平明显增高(P＜0.001;P＜0.01)。见表1。

2.2 UAP组与对照组的MCP-1-2518G/A多态性分析 MCP-1 A-2518G多态性PCR产物经酶切后电泳显示GG(159 bp和75 bp)、GA(234 bp、159 bp和75 bp)和 AA(234 bp)三种基因型(图1)。本研究人群经χ2检验符合Hardy-Weinberg遗传平衡规律(P＞0.05)，具有群体代表性。与对照组比较，UAP组AA基因型频率较高，G等位基因频率低于对照组(P=0.044);多变量(多因素包括年龄，性别，吸烟，高血压病，糖尿病及血脂异常)Logistic回归分析发现MCP-1-2518G/A多态性不增加UAP易感性。见表2。

表1 UAP组与对照组的临床资料比较

表2 UAP组与对照组的MCP-1-2518G/A多态性分布〔n(%)〕

2.3 UAP组与对照组的血清MCP-1水平比较 血清MCP-1水平在 UAP组〔(286.23±284.20)pg/ml〕显著高于对照组〔(172.61 ±178.70)pg/ml〕(P=0.005)。

图1 MCP-1 2518G/A多态性PCR产物酶切电泳图

2.4 血清MCP-1水平的影响因素 多元线性回归分析赋值为:基因型:AA型=0，GA+GG型 =1;年龄:＜60岁 =0，≥60岁=1;性别:女性=0，男性=1;高血压史:无=0，有=1;糖尿病史:无=0，有=1;吸烟:不吸烟=0，吸烟=1;血脂水平:正常为0，不正常=1。结果显示，血清 MCP-1水平与下列因素相关(P＜0.001，R2=0.429):与高血压、糖尿病和吸烟呈正相关，与男性呈负相关。见表3。

2.5 MCP-1-2518G/A多态性对血清MCP-1水平的影响 血清MCP-1水平在UAP组和对照组组内任何基因型之间皆无显著差异。见表4。

表3 血清MCP-1水平的影响因素

表4 血清MCP-1水平在UAP组和对照组组内基因型间比较

2.6 血清MCP-1水平与UAP发病风险的相关性 多变量(包括年龄:＜45岁=1、45～54岁 =2、55～64岁 =3、≥65岁 =4;血清MCP-1水平:＜302.23 pg/ml=0、≥302.23 pg/ml=1;性别、吸烟、高血压、糖尿病和血脂水平赋值标准同上)Logistic回归分析揭示≥75%分位数的血清MCP-1水平(302.23 pg/ml)是UAP发病的独立危险因素〔OR(95%CI):2.904(1.058～7.970)，P=0.039〕。

3 讨论

目前认为UAP与多种环境因素和遗传因素有关，炎症和免疫反应在其发病过程中发挥重要作用。MCP-1通过招募和活化单核细胞进入血管壁而影响动脉粥样硬化的发展〔8〕。在一些非人灵长类的动脉粥样硬化的动物模型中阻断MCP-1的作用不仅导致动脉粥样硬化斑块面积明显缩小，还使得斑块转变成一种更稳定的类型〔9〕。在一些人类流行病学研究中发现ACS患者的血清MCP-1水平明显高于正常人，并且高MCP-1血清水平与与 ACS 相关〔3，4〕。Brad〔10〕等发现 MCP-1 基因远端调控区2518G/A多态性影响MCP-1的转录活性。

本研究与捷克〔7〕和日本〔6〕人群的心肌梗死以及中国〔11〕人群的早发冠心病研究结果基本一致，即MCP-1-2518G/A多态性与心肌梗死/早发冠心病的发病风险无关;但不支持弗明翰地区人群携带MCP-1-2518G/A G等位基因者的心肌梗死发病风险增高〔5〕以及斯洛伐克人群MCP-1-2518G/A多态性与缺血性心脏病和早发心肌梗死存在相关性〔12〕的结论。这种差异可能与下列因素有关:(1)研究人群的遗传背景不同:捷克、日本和中国人群中 MCP-1-2518位点 G 等位基因频率约60%〔6，7，11〕，而弗明翰、斯洛伐克地区人群中MCP-1-2518位点G等位基因频率约30%〔5，12〕;(2)对照组的入选标准不同:本文对照组是经冠脉造影排除冠脉病变者;(3)研究样本量大小不同:本研究和斯洛伐克人群研究的样本量远小于弗明翰人群研究。

本研究发现MCP-1-2518G/A多态性不影响其血清MCP-1水平，验证了中国早发冠心病〔11〕以及捷克〔7〕和日本〔6〕人群的心肌梗死患者MCP-1-2518G/A多态性不影响血清MCP-1水平的结论，但不支持弗明翰地区人群携带MCP-1-2518G/A G等位基因者血清MCP-1水平显著增高的研究结果〔5〕。上述研究结果的差异很可能与不同种族人群的MCP-1-2518G/A多态性不同及其对血清MCP-1水平的影响不同、所入选对象不同有关。

本研究所显示UAP患者血清MCP-1水平明显升高的结果与既往报道〔3～5，12〕基本一致，≥75%分位数的血清 MCP-1水平与UAP发病风险相关的现象与de Lemos〔3〕等研究结果基本相符。而且，笔者还验证了 Iwai〔6〕和 de Lemos〔3〕等所报道的研究结果，即血清MCP-1水平受到高血压、糖尿病、吸烟和性别等冠心病传统危险因素的影响。因此，尽管UAP患者血清MCP-1水平显著升高以及≥75%分位数的血清MCP-1水平与UAP发病风险相关，但由于血清MCP-1水平受多种临床因素的影响，且在UAP组和对照组分布明显重叠，从而限制了其在预测、诊断UAP中的应用。

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