黄芩苷对动脉粥样硬化大鼠血浆TAFI及hs-CRP、IL-6水平的影响

顾琼琼 刘向群 王 敏 于 昕 (山东大学齐鲁医院干部保健科，山东 济南 250012)

动脉粥样硬化(AS)及其并发症是心脑血管疾病的重要病理生理基础，发病机制复杂。近年来的研究显示，AS是一种多因素疾病，炎症贯穿于动脉硬化发展的整个过程，是动脉硬化发生发展的中心环节，炎症因子在AS发生发展过程中起到了重要作用〔1，2〕。黄芩苷是中药黄芩的主要有效成分，具有抗炎、抑制血管平滑肌的增殖 、脂氧化酶及抗氧化、调节免疫等作用，从理论上来讲其可作为预防AS的有效天然药物应用。本研究通过观察黄芩苷对AS大鼠血浆凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)、高敏C-反应蛋白(hs-CRP)及白介素(IL)-6水平的影响，探讨黄芩苷在干预AS发生发展过程中的机制。

1 材料与方法

1.1 材料及主要仪器 健康雄性的Wistar大鼠，8周龄，体重300～400 g，由山东大学实验动物中心提供。黄芩苷:黄色粉末，购自四川协力制药有限公司，批号:国药准字20053191，相对分子质量为446.35，临用时用生理盐水配制成25 mg/ml，于棕色容器中密闭储存。酶标仪:山东省医学科学院基础医学实验室提供(Model 550型，美国 BIO-RAD公司生产)。大鼠hs-CRP、IL-6酶联免疫检测(ELISA)试剂盒购自美国R＆D公司。TAFI发色底物试剂盒为美国DIAGNOSTICA公司生产，购自上海船夫生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高脂饮食配制方法 按照3%胆固醇、0.5%胆酸钠、5%白糖、10%猪油、5%蛋黄粉、76.5%标准饲料比例配制。

1.2.2 动物模型制备及给药方法 采用高脂饮食+主动脉内皮球囊损伤+VD3注射方法建立大鼠AS模型。健康雄性的Wistar大鼠40只，先用普通饲料适应性喂养7 d后随机分配到假手术组、模型组、黄芩苷高、低剂量组，每组10只。假手术组大鼠在实验开始第7天行假主动脉内皮球囊损伤术，模型组、黄芩苷高、低剂量组大鼠在实验开始7 d后给予主动脉内皮球囊损伤术。然后假手术组继续给予普通饲料喂养;其余3组用高脂饲料喂养(15～25 g/d)，与此同时，在实验开始时右下肢肌肉注射维生素D3针剂(30万U/kg)，每隔30天重复1次。给药方法:适应性喂养1 w后，假手术组和模型组给予生理盐水5 ml灌胃，每天1次;黄芩苷高剂量组给予黄芩苷100 mg·kg－1·d－1灌胃，每天 1 次;黄芩苷低剂量组给予黄芩苷50 mg·kg－1·d－1灌胃，每天 1 次。

1.3 TAFI活性的测定 采用美国DIAGNOSTICA公司生产的TAFI ELISA试剂盒，经美国产BIO-RAD Model550型全自动酶标仪测定，采用发色底物法，步骤严格按照说明书进行。

1.4 hs-CRP和IL-6活性测定 hs-CRP和IL-6活性测定试剂盒购于美国R＆D公司，由山东省医学科学院基础医学实验室提供的美国BIO-RAD Model550型全自动酶标仪进行检测，均采用酶联免疫吸附法，步骤严格按照说明书进行。

2 结果

2.1 实验4月后各组大鼠血浆TAFI、hs-CRP及IL-6的比较 与假手术组比较，模型组、黄芩苷高剂量组和黄芩苷低剂量组的TAFI、hs-CRP及IL-6水平明显升高(P＜0.01);与模型组比较，黄芩苷高低剂量组TAFI、hs-CRP及IL-6水平均明显降低(P＜0.01或P＜0.05);黄芩苷高低剂量组间比较，高剂量组hs-CRP和IL-6水平明显低于低剂量组(P＜0.05)，TAFI水平则无统计学差异(P＞0.05)。见表1。

2.2 TAFI水平与hs-CRP、IL-6的相关性分析 将全部研究对象作为一个整体，对TAFI活性水平与hs-CRP、IL-6进行直线相关分析，结果显示，在大鼠AS发展过程中，TAFI活性水平与hs-CRP、IL-6均呈正相关(r分别为 0.278、0.547，P ＜0.01 或P＜0.05)。

表1 实验4个月后不同组间TAFI水平及hs-CRP、IL-6的比较(± s，n=10)

表1 实验4个月后不同组间TAFI水平及hs-CRP、IL-6的比较(± s，n=10)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01，3)P＜0.05;与黄芩苷高剂量组比较:4)P＜0.05

组别 hs-CRP(ng/L) IL-6(ng/L) TAFI(mg/L)假手术组85.66±10.73 38.95±1.99 29.5±0.05模型组 169.16±11.531) 76.24±4.321) 36.8±4.571)黄芩苷高剂量组 97.27±6.891)2) 42.41±1.591)2) 32.7±2.361)3)黄芩苷低剂量组 109.21±8.511)2)4)53.67±2.21)2)4) 31.3±1.571)3)

3 讨论

郭延松〔3〕等综合脂质浸润学说、钙超载学说、内皮损伤学说、血栓形成学说等理论，成功地建立了大鼠AS模型。他们发现，大鼠可作为研究AS的良好动物模型，高脂饮食+主动脉内皮球囊损伤+VD3负荷可形成较成熟的AS斑块。本课题组刘利妍等〔4〕研究发现，应用高脂饮食+主动脉内皮球囊损伤+VD3负荷的方法喂养大鼠4个月，可成功复制AS模型。也就是说用高脂饮食+主动脉内皮球囊损伤+VD3负荷的方法复制AS模型是成熟可靠的。

Tregouet等〔5〕研究认为，活化的TAFI是冠心病患者远期心血管病事件危险性的独立预测因素。Schroeder等〔6〕对冠状动脉疾病患者和对照组的研究发现，冠心病患者的静脉和冠状动脉的TAFI水平比对照组升高，具有显著的统计学差异，而且TAFI水平与总胆固醇、纤维蛋白水平和急性期反应物水平具有相关性，提示在冠心病患者体内TAFI参与炎症的调节。刘利妍等〔4〕研究发现，在AS发展过程中，随着AS病变的加重，TAFI水平逐渐升高，并且与TG、TC水平呈正相关，说明TAFI参与AS的形成。本研究显示TAFI在AS进展过程中发挥了重要作用。

C反应蛋白(CRP)主要在 IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-1等炎性递质调节下由肝细胞合成，不仅是反映炎症反应的指标，其本身还有炎症因子的作用，直接参与AS的形成和发展〔7〕，可以促进单核细胞向血管壁的黏附、下调内皮细胞一氧化氮合酶和前列环素的合成、激活内皮细胞核转录因子NF-κB、促进平滑肌细胞的迁移增生和胶原降解。尤其是近年来hs-CRP检测技术得到应用，可准确测定低浓度 CRP(0.15～10.00 mg/L)，hs-CRP作为炎症标志物被认为是心血管事件危险性最强有力的预测因子。高水平的hs-CRP还可通过促进纤溶酶原激活物抑制因子表达与纤维蛋白原一起参与血栓形成〔8〕，而且有临床研究表明，C-反应蛋白与血浆TAFI浓度成正相关〔9〕。本研究亦显示，在AS大鼠模型中，TAFI活性水平升高，与hs-CRP、IL-6均呈正相关。

IL-6与CHD的发生、发展存在一定的关系，Choussat等〔10〕研究表明，IL-6作为炎症细胞分化的主要调节因子，促进激活的巨噬细胞分化和浸润，还可以上调黏附分子和其他细胞因子的表达，从而加强炎症反应。Aydin等〔11〕研究认为，冠心病患者的血清中炎性细胞因子如IL-6、TNF-α的水平显著升高。另有临床研究证实〔12〕，IL-6在CHD患者循环水平显著高于正常人群，而且血清IL-6水平的改变对日后发生的冠脉事件具有预测价值。

Ross发现〔1〕当炎症反应引起内皮损伤时，hs-CRP在IL-6调节下由肝细胞合成，前者通过激活补体系统引起脂质沉积，此时hs-CRP明显升高。CRP在转录水平上由IL-6调节合成，CRP的升高是体内“瀑布式”炎症反应中的一个环节，反过来可刺激IL-6的合成，形成CRP与IL-6之间的恶性循环。而且，IL-6还可以通过影响CPB2 mRNA的稳定性使其浓度降低，进而下调TAFI的表达〔13〕。本研究显示，应用黄芩苷干预动脉粥样硬化大鼠后，血浆IL-6、hs-CRP水平明显下降，其机制可能为IL-6水平降低，进而在转录水平上使hs-CRP表达下调，起到了在炎症层面干预动脉粥样硬化的作用。

黄芩苷的心血管保护作用主要有抗炎、清除氧自由基、抗缺血再灌注损伤等。在本研究中，在AS模型组应用黄芩苷干预后hs-CRP、IL-6水平明显降低，而以往的研究表明hs-CRP、IL-6水平与AS的发生发展相关联〔7，11〕，提示黄芩苷有抗AS炎症过程的作用，可预防AS的发生和发展。黄芩苷干预后TAFI水平降低，可以恢复机体的凝血纤溶系统之间的精细平衡，进而减少纤维蛋白沉积〔14〕。而且TAFI水平和hs-CRP、IL-6水平成正相关，黄芩苷可能通过降低AS过程中炎症因子的表达进而降低TAFI的表达，恢复凝血纤溶系统之间的精细平衡来干预AS的发生发展。

黄芩苷作为一种天然药物，具有毒性低、副作用小等优点，有待进一步深入的基础实验研究和大规模的临床试验研究来进一步证实其在起始阶段防治AS中的作用机理及临床应用价值，为临床AS及其相关疾病的防治开辟新的途径。

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2 Chen ZY，Su YL，Lau CW，et al.Endothelium-dependent contraction and direct relaxation induced by baicalein in rat mesenteric artery〔J〕.Eur J Pharmacol，1999;374(1):41-7.

3 郭延松，吴宗贵，杨军柯，等.三种大鼠动脉粥样硬化模型复制方法的比较〔J〕.中国动脉硬化杂志，2003;11(5):465-9.

4 刘利妍，刘向群，陈焕芹，等.大鼠动脉粥样硬化形成中凝血酶激活的纤溶抑制剂与血脂及凝血的关系研究〔J〕.中国病理生理杂志，2008;24(4):712-5.

5 Tregouet DA，Schnabel R，Alessi MC，et al.Activated thrombin activatable fibrinolysis inhibitor levels are associated with the risk of cardiovascular death in patients with coronary artery disease:the atherogene study〔J〕.J Thromb Haemost，2009;7(1):49-57.

6 Schroeder V，Chatter T，Mehta H，et al.Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor(TAFI)levels in patients with coronary artery disease investigated by angiography〔J〕.Thromb Haemost，2002;88(6):1020-5.

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11 Aydin M，Tekin IO，Dogan SM，et al.The levels of tumor necrosis factoralpha and interleukin-6 in patients with isolated coronary artery ectasia〔J〕.Mediators Inflamm，2009:106145.

12 Ikeda U，Ito T，Shimada K，et al.Interleukin-6 and acute coronary syndrome〔J〕.Clin Cardiol，2001;24(1):701.

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