肝动脉化疗栓塞术对老年原发性肝细胞癌患者CD4+CD25+调节性T细胞的影响

徐慧宁 纪 民 徐逢敏 (大连市第六人民医院，辽宁 大连 116000)

老年肝癌病人由于体质虚弱，对肝脏切除手术的耐受性较差，肝动脉化疗栓塞术(TACE)目前是原发性肝细胞癌(HCC)患者非手术治疗的首选，可以显著提高其生存率。调节性T细胞作为免疫抑制细胞(Treg)在肿瘤的发生、发展过程中发挥着极为重要的作用。本文着重探讨TACE治疗对HCC患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2009年5月至2011年5月我院HCC患者37例，诊断参照1999年第四届全国肝癌学术会议制定的《原发性肝癌临床诊断标准》HCC诊断标准:①至少有通过两种影像学检查证实病变具有HCC特征;②通过一种影像学检查证实同时AFP＞400 μg/L;③有细胞学或组织学证据。影像学检查结果由至少两位不同放射科医生共同确认。巴塞罗那临床肝癌(BCLC)分级B级，肿块无远处转移，肝功能为Child-Pugh A或B级。首次住院且行TACE治疗，病理证实为HCC。男28例，女9例，年龄62～70岁。治疗前患者均未接受任何抗肿瘤治疗和免疫治疗，TACE治疗前2～3 d及治疗后4 w，抽取患者清晨空腹外周静脉血1 ml，置于枸橼酸钠抗凝管中，送流式细胞室检测。

1.2 TACE 采用常规Seldinger技术，经皮股动脉穿刺，选择导管至肿瘤供血动脉，根据肿瘤血供情况进行栓塞，TACE治疗方案为氟尿嘧啶750～1 000 mg、顺铂40～80 mg、丝裂霉素20 mg或表柔比星40～60 mg加超液化碘油5～20 ml，至碘化油沉积致密。

1.3 主要试剂和仪器 美国BD流式细胞仪，CD25-FITC，CD25-APC，CD4-PerCP5，CD4-FITC，CD127-PE foxP3-PE 以及相应的同型对照抗体均购自美国BD公司;破膜固定液及破膜缓冲液:购自美国BD Biosciences公司。

1.4 流式细胞仪检测CD4+CD25+Tregs 采集新鲜的枸橼酸钠抗凝血 1 ml，使用密度梯度离心法分离 PBMC，取约1 ×105个细胞加入 5 μl CD25-FITC，CD4-PerCP5，CD127-PE，3组荧光标记抗体，振荡器混匀，室温避光孵育30 min，PBS洗涤1次，离心后弃上清，加入少量PBS制成单细胞悬液;另取大约1×105个细胞，加入5 μl CD25-APC和CD4-FITC，振荡器混匀，室温避光染色30 min后，破膜固定15 min，应用破膜缓冲液进行洗涤一次，离心后弃上清，加入正常鼠血清进行阻断，加入5 μl FoxP3-PE进行胞内染色，室温避光染色30 min后应用PBS洗涤1次，离心后弃上清，加入PBS制成单细胞悬液。上机使用FlowJo软件收获细胞并进行分析。

2 结果

2.1 CD4+CD25+foxp3+T细胞和CD4+CD25+CD127low/-T细胞流式细胞检测结果 见图1。

图1 CD4+CD25+Tregs的测定

2.2 外周血Tregs水平 CD4+CD25+foxp3+T细胞和CD4+CD25+CD127low/-T细胞流式细胞检测结果占CD4+T淋巴细胞的比例在TACE治疗4 w后较治疗前均有所降低(〔(4.16% ±1.83%vs 2.56% ±1.05%，P＜0.01)，(6.78% ±2.82%vs 4.94% ±0.56%，P＜0.01)〕。

3 讨论

本结果表明老年HCC患者外周血CD4+CD25+Tregs占CD4+T细胞的比例和经TACE治疗前比较，无论是以经典的CD4+CD25+foxp3+或是以 CD4+CD25+CD127low/-为表型标志鉴定后，数值上均有显著下降。分析原因，考虑有以下几个方面:CD4+CD25+Tregs是具有低增殖性和免疫抑制特性的T细胞亚群〔1〕。体外研究试验表明CD4+CD25+Treg抑制作用的发挥是通过细胞接触实现的，其功能的发挥是剂量依赖性的〔2〕。Tregs与各种肿瘤的发生和发展密切相关〔3〕，多种肿瘤患者的Treg细胞水平增高〔4〕，肿瘤局部微环境中 Treg数量明显增多〔5～7〕，在对原发性肝癌的研究中，对肿瘤局部微环境中Treg细胞数量的研究结果同样是增多〔8〕，这可能间接导致了外周血调节性T细胞增多，TACE治疗去除了肿瘤的实体细胞，使得肿瘤微环境中的Tregs减少了，间接导致了外周血中Treg下降。另一方面，TACE治疗过程中应用的化疗药物等因素影响了对机体的免疫功能，减少了外周血调节性T细胞上调的因素，导致TACE治疗后外周血中Treg下降。

本文研究外周血中的Treg，是因为Treg细胞水平可作为评价及判断预后的指标〔5～7〕，Tregs细胞数量及功能的增高往往预后不良〔7，9〕，但现有研究主要针对肿瘤局部的Treg数量和功能，在临床中应用面较局限，不能很好地指导临床，以foxp3作为调节性T细胞的鉴定标志，由于需要破膜处理细胞，不但使结果不稳定，而且导致细胞破坏，不利于Tregs进一步分离与研究。本实验分别以CD4+CD2 5+foxp3+和CD4+CD 2 5+CD127low/-作为Treg细胞的表型鉴定，分析其占CD4+T细胞百分比，结果比较可靠。Liu等〔10〕研究发现 CD127低表达与Foxp3表达有高度一致性，故检测CD4+CD25+CD127low/-T细胞亦可较好地反映外周血中CD4+CD25+Tregs的百分比，其结果稳定，不破坏细胞本身。

综上，HCC患者外周血Tregs水平是升高的，且用CD127低表达和Foxp3阳性表达两种方法检测HCC患者外周全血结果相一致，外周血中调节性T细胞的检测较肿瘤微环境中Treg检测更具有临床应用的价值;应用CD127作为标志的检测方法更加便捷，且不会破坏细胞本身;TACE治疗可能影响调节性T细胞，从而影响老年肝癌患者的免疫功能，提示在原发性肝癌的治疗过程中，检测外周血中的Treg可以更好地判断治疗效果，评估预后。

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