自噬相关蛋白Beclin-1在乳腺浸润性导管癌中的表达及临床意义

顾栋桦 徐 炜 董吉顺 平金良

(湖州市中心医院,浙江 湖州 313000)

Beclin-1是一个自噬(autophage)相关蛋白,参与细胞的凋亡、自噬及增殖等过程的调节。研究发现许多恶性肿瘤中Beclin-1表达降低或缺失,在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用[1]。Beclin-1在乳腺癌中的作用和机制目前了解较少,本实验通过免疫组织化学的方法检测乳腺浸润性导管癌中Beclin-1的表达,探讨其与乳腺癌临床病理参数的关系及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择本院2005～2010年外科改良根治的72例原发乳腺浸润性导管癌及配对癌旁乳腺存档石蜡组织块,所有患者术前均未接受过放化疗及生物治疗,均为女性,年龄28～65岁,中位年龄44岁。其中34例伴淋巴结转移,临床TNM分期按美国癌症联合委员会(AJCC)标准[2],Ⅰ-Ⅱ期47例,Ⅲ-Ⅳ期25例。组织切片由两名高年资病理医生按WHO分级标准进行病理分级[3]；另选取乳腺良性病变21例(包括10例乳腺纤维腺瘤、5例单纯性乳腺导管上皮增生和6例乳腺小叶增生)作为对照组,所有组织均经4%中性甲醛固定,常规脱水浸蜡,常温保存。

1.2 方法 考察Beclin-1在乳腺浸润性导管癌、癌旁乳腺组织及乳腺良性病变中的表达情况,以及Beclin-1的表达与各病理临床参数(肿瘤大小、患者年龄、TNM分期、病理分级、ki-67阳性分级及淋巴结转移情况)之间的关系。

1.2.1 免疫组织化学 免疫组织化学采用EnVision二步法；小鼠抗人ki-67抗体(工作浓度均为l∶200)以及EnVision试剂盒均为丹麦Dako公司产品,兔抗人Beclin-1多克隆抗体(工作浓度1∶100)购于英国Abcam公司。石蜡切片厚度4μ m。实验步骤参照试剂盒说明书进行,简述如下∶切片脱蜡至水,微波修复抗原,3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性,TBS漂洗3次×5分钟,滴加一抗,37℃孵育1小时,TBS漂洗3次×5分钟,EnVision试剂37℃孵育30分钟,TBS漂洗3次×5分钟,3,3-二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木精衬染、脱水透明、封片。用TBS代替一抗做为空白对照,组织中正常乳腺导管上皮为阳性对照。

1.2.2 结果评定 采用双盲阅片,信号强度半定量评分参考文献[4],每张切片随机选5个200倍视野观察,计算阳性细胞百分率。Beclin-1蛋白以细胞质出现棕黄或棕红色颗粒为阳性信号,阳性细胞百分率＜30%为阴性(-),30%～60%之间为(+),＞60%为(++)；Ki-67以细胞核出现棕黄或棕红色颗粒为阳性信号,＜5%为(-),＜25%为(+),＜50%为(++),≥50%为(+++)。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.5软件对数据结果进行统计分析,组间比较采用 χ2检验。

2 结 果

2.1 Beclin-1在乳腺浸润性导管癌中的表达Beclin-1主要表达于细胞质中,呈现棕黄或棕红颗粒,癌旁正常乳腺组织及乳腺良性病变组中Beclin-1阳性率均为100%,阳性信号主要分布于乳腺导管上皮细胞质中(见第467页图1)；而乳腺浸润性导管癌中Beclin-1阳性信号主要定位于肿瘤细胞质中(见第 467页图2),阳性率为47.2%(34/72例),与乳腺良性病变及癌旁乳腺组织相比Beclin-1表达明显下调,具有显著性差异(χ2值分别为18.74和51.63,均 P＜0.01),详见表1。

表1 Beclin-1在乳腺病变组织中的表达

2.2 Beclin-1表达与临床病理参数的关系Beclin-1的表达与乳腺癌的病理分级有关(P＜0.05),与肿瘤的大小、患者年龄、TMN分期及淋巴结转移情况无关(均P＞0.05)。作者按ki-67细胞阳性率把肿瘤分为低增殖(+～++)和高增殖组(+++),显示高增殖组的Beclin-1阳性率明显低于低增殖组(P＜0.05),详见表2。

表2 Beclin-1的表达与病理临床参数之间的关系

3 讨 论

自噬是细胞在遇到环境压力(如营养缺乏、缺氧、毒性药物等)时,在细胞内形成具有双层或多层包膜包裹细胞器形成吞噬泡,继而发生细胞器的降解和转化,自噬的最终结局是细胞程序性死亡。目前发现许多肿瘤细胞出现自噬功能的异常,但其机制尚不清楚[5]。Beclin-1是Liang等通过酵母双杂交发现的一个能与Bcl-2相互作用的蛋白,参与自噬活性的调节,并且在许多肿瘤组织中表达降低甚至缺失[6]。研究发现用外源性的Beclin-1基因导入乳腺癌MCF-7细胞株后,细胞自噬增强,肿瘤细胞的体外增殖能力明显降低。该研究还发现,从正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤、交界性卵巢肿瘤到上皮性卵巢癌组织,Beclin-1的表达逐渐下调[7]。在食管癌[8]、胃癌组织[9]中,Beclin-1的表达也呈明显降低的趋势。因此,Beclin-1可能是一个抑癌基因,在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。

本实验中,Beclin-1表达阳性率在癌旁乳腺组织及乳腺良性病变组织中均为100%,说明Beclin-1在正常乳腺的生长和生理过程调控中可能发挥重要作用。免疫组化结果显示72例乳腺浸润性导管癌组织中Beclin-1的表达阳性率只有47.2%,部分病例Beclin-1蛋白表达减少甚至缺失；并且其表达与肿瘤的病理分级有关(P＜0.05),分化越差Beclin-1阳性率越低,提示Beclin-1的下调可能是导致乳腺癌发展的因素。细胞增殖能力是影响肿瘤预后的重要影响因素,ki-67细胞阳性率是判断细胞增殖能力的常用参考指标。作者把乳腺癌分为两组∶ki-67高表达组及低表达组,结果显示ki-67低表达组的Beclin-1阳性率明显高于ki-67高表达组,意味着Beclin-1表达降低与肿瘤细胞增殖能力的增高有关。但Beclin-1调控细胞增殖的机制尚不清楚,有待进一步研究。

[1]赵剑虹,万小云,谢幸.自噬相关基因Beclin 1与肿瘤.国际遗传学杂志,2007,30(1)∶48

[2]Tavassoli F A,Devilee P.World Health Organization.Classification of tumours∶pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs,2003,Lyon∶IARC Press

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[4]Ahn C H,Jeong E G,Lee J W,et al.Expression of beclin-1,an autophagy-related protein,in gastric and colorectal cancers.APMIS,2007,115(12)∶1344

[5]Chen N,Karantza-Wadsworth V.Role and regulation of autophagy in cancer.Biochim Biophys Acta,2009,1793(9)∶1516

[6]Liang X H,Kleeman L K,Jiang H H,et al.Protection against fatal Sindbis virus encephalitis by beclin,a novel Bcl-2-interacting protein.J Virol,1998,72(11)∶8586

[7]Liang X H,JacksonS,Seaman M,et al.Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1.Nature,1999,402(6762)∶672

[8]单国用,刘兴安,张松,等.食管鳞状细胞癌组织中自噬基因Beclin 1蛋白的表达.郑州大学学报(医学版),2010,45(3)∶366

[9]郭长青,邵经浩,卢瑞利,等.胃癌组织中Beclin 1和PTEN蛋白的表达.郑州大学学报(医学版),2010,45(3)∶463