一种复合益生菌饲料添加剂制备及饲喂试验

刘晓东 成珍 赵洁 赵富责 易卿 胡书才

1.河南省农业微生物工程技术研究中心，河南三门峡 472143；2.三门峡龙飞生物工程有限公司，河南三门峡 472143

河南省农业微生物工程技术研究中心联合三门峡龙飞生物工程有限公司研制的益生菌饲料添加剂是根据动物学原理，筛选出安全性高、抗病性好、产酶量大的芽孢杆菌、乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌等有益菌群经特殊工艺复合而成。其中，芽孢杆菌、酵母菌可产生大量的消化酶，能够促进畜禽肠胃消化和吸收、增加食欲、促进排便，并能提高饲料利用率和畜禽生产能力，增加养殖户的经济收入；乳酸菌产生的有机酸，可以抑制多种革兰氏阴性病原菌的繁殖，使畜禽粪便和血液中的氨含量降低，明显缓解圈舍的氨味和臭味，改善养殖环境。大量有益菌进入畜禽肠道后，增加了肠道内的有益菌量，有效抑制了病原菌的繁殖，增强了畜禽的抗病能力；同时，还可以合成大量的氨基酸、维生素等营养物质。

1 材料与方法

1.1 菌 种

枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、乳酸乳杆菌及两歧双歧杆菌均由河南省农业微生物工程技术研究中心提供。

1.2 培养基

1）乳酸乳杆菌和两歧双歧杆菌培养基。MRS固体培养基：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，无水乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，柠檬氢二铵2g，水合硫酸镁580mg，水合硫酸锰280mg，琼脂20g，蒸馏水1 000mL，调pH值6.5、121℃高压灭菌20min。MRS液体培养基：配方同上，不加琼脂。

2）枯草芽孢杆菌培养基。牛肉膏蛋白胨固体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1 000mL，调pH 值7.0～7.2、121℃高压灭菌20min。牛肉膏蛋白胨液体培养基：配方同上，不加琼脂。

3）产朊假丝酵母培养基。麦芽汁固体培养基：麦芽汁1 000mL，琼脂20g，pH 值自然（约6.4）、121℃高压灭菌20min。麦芽汁液体培养基：配方同上，不加琼脂。

1.3 菌种筛选活化及悬浮液制备

1）乳酸乳杆菌和两歧双歧杆菌筛选活化及悬浮液制备。将河南省农业微生物工程技术研究中心保藏的乳酸乳杆菌和两歧双歧杆菌分别接种于牛奶溶液中，37℃厌氧培养72h，牛奶凝固。取0.1mL凝乳加入9.9mL无菌水进行稀释，制得乳酸乳杆菌和两歧双歧杆菌悬液。将菌悬液在MRS固体培养基上进行平板划线分离后，37℃厌氧培养72h，对平板中的菌落进行革兰氏染色，显微镜观察，选出合适的菌转接备用。

从筛选出的优良菌种的固体培养基平皿上挑取菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养72h；以接种环蘸取1环菌液，在MRS固体培养基上划线接种，37℃厌氧培养72h。依此连续传接3代，测其活菌数；用无菌移液管取最后1代细胞培养液1mL进行梯度稀释，至合适的稀释度；再取0.1 mL稀释液，采用平板计数法进行菌落计数；取活菌浓度达108cfu／mL的相应稀释菌悬液，置于冰箱，4℃保存备用。

2）枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母的筛选活菌及菌悬浮液制备。分别将枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母菌种制成菌悬浮液，对菌悬浮液进行平板划线分离，置37℃培养24h（枯草芽孢杆菌）和28℃培养72h（产朊假丝酵母），经镜检，挑选出合适的菌株转接备用。分别从筛选出的优良菌的固体培养皿上挑取菌落，接种于枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母的液体培养基中，置37℃培养24h（枯草芽孢杆菌）和28℃培养72h（产朊假丝酵母）；依此连续传接3代，梯度稀释，采用平板计数法进行菌落计数；取活菌浓度达108cfu／mL的相应稀释菌悬液，置于冰箱，4℃保存备用。

1.4 种子液制备

1）乳酸乳杆菌种子液制备。分别将乳酸乳杆菌及两歧双歧杆菌混合悬浮液按2%的接种量，接种于装有100mL MRS液体培养基的三角瓶中，37℃厌氧培养72h，待活菌浓度达到108cfu／mL，即可作为乳酸乳杆菌及两歧双歧杆菌发酵工艺优化的种子液。

2）枯草芽孢杆菌种子液的制备。将枯草芽孢杆菌悬浮液以2%的接种量，接种于装有100mL牛肉膏液体培养基的三角瓶中，37℃培养24h，待活菌浓度达到108cfu／mL，即可作为枯草芽孢杆菌发酵工艺优化的种子液。

3）产朊假丝酵母种子液的制备。将产朊假丝酵母悬浮液以2%的接种量，接种于装有100mL麦芽汁液体培养基的三角瓶中，28℃培养72h，待活菌浓度达到108cfu／mL，即可作为产朊假丝酵母发酵工艺优化的种子液。

1.5 工艺流程

1.6 菌种一级扩培

将麦麸、米糠粉碎后，按9∶1比例加水混合，蒸汽灭菌，冷却后水分约30%～35%，基础蛋白含量16%左右。然后分别将枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、产朊假丝酵母种子液按1%的接种量接种在固体物料上。酵母菌温度控制在25～30℃，培养24h；芽孢杆菌温度控制在40～50℃，培养48h；乳酸菌温度控制在37℃左右，厌氧培养72h。最后经低温干燥后，保存备用。

1.7 复合益生菌饲料添加剂发酵

将麦麸、豆粕、米糠粉碎后，按8.5∶0.5∶1.0比例加水混合均匀，使物料水分达到30%～35%，基础蛋白含量16%左右。然后将酵母菌、芽孢杆菌、乳酸菌的一级扩培菌种按2%接种量接入固态物料中，混合均匀，分别进行发酵。发酵温度及培养时间同上，发酵过程温度变化情况如图1所示。

图1 发酵过程温度变化

1.8 复合益生菌饲料添加剂烘干及混合

将发酵好的物料进行低温烘干（温度≤50℃），然后根据饲喂对象对微生物的需求进行混合配比，经抽样检测合格后包装、入库。

1.9 饲喂操作

选择新美系40日龄的仔猪100头，按照体重相近原则，随机分为试验组和对照组，每组各设5个重复，每个重复设置10头猪，试验组饲喂基础日粮＋2%益生菌饲料添加剂，对照组饲喂基础日粮。先经过5d换料期，使猪适应此饲料，再进行为期100d的对比试验。采用方差分析的方法进行差异分析。

2 结果与分析

2.1 感官检测

发酵前，手握物料成团，无明显水样，颜色为原料的本来色泽，无其他气味。发酵中期，酵母菌有酵母香味（发酵24h后），颜色较深；芽孢杆菌有特殊的腥味（发酵48h后），手捏物料有滑感，而且肉眼可看到菌丝；乳酸菌稍有酒香味和酸甜味（发酵72h后），颜色变黄。发酵后期，酵母菌酵母香味更浓，色泽暗黄，手握成团，松开呈蓬散状；芽孢杆菌的特殊腥味更浓，菌丝很多，色泽暗黄，手握成团，松开呈蓬散状；乳酸菌带有浓郁的酒香味和酸甜味，色泽金黄，手握成团，松开呈蓬散状。

2.2 常规分析

对发酵后的益生菌饲料添加剂进行常规分析，结果见表1。

表1 复合益生菌饲料添加剂部分成分分析 %

2.3 活菌数测定

益生菌饲料添加剂活菌数测定采用的是平板培养计数法测定样品中的活菌数量。产朊假丝酵母用马丁培养基测定，活菌数为4.50×109个／g以上；枯草芽孢杆菌用牛肉膏培养基测定，活菌数为6.50×109个／g以上；乳酸乳杆菌用 MRS培养基在厌氧箱培养测定，活菌数为3.50×108个／g以上；两歧双歧杆菌用MRS培养基在厌氧箱培养测定，活菌数为1.68×108个／g以上。

2.4 pH值测定

益生菌饲料添加剂成品pH值检测结果为6.89，接近中性，适用于多种畜禽。

2.5 酶活测定

益生菌饲料添加剂成品酶活测定结果为：淀粉酶活力≥312U／g；蛋白酶活力≥550U／g；纤维酶活力≥518U／g。

2.6 猪只生长状况及经济效益分析

益生菌饲料添加剂对猪的生长影响见表2、3，经济效益分析见表4。

表2 试验期观察

表3 益生菌饲料添加剂对育肥猪生长性能的影响

表4 经济效益分析

由表2常规观察可见，试验期试验组的猪只食欲旺盛、肤色发红、体格健壮、生长整齐、臂大腰圆且没有出现腹泻病例，对照组的猪只食欲一般、生长不齐，且有12%的猪发病。由表3计算可知，试验期试验组猪只平均日增重比对照组提高了8.89%，料肉比降低了6.18%，平均日采食量提高了2.27%，差异显著（P＜0.05）。由表4可知，试验组平均每头猪净利润比对照组提高了9.24%，即平均每头猪增加了57.10元收入，经济效益显著（P＜0.05）。这说明益生菌饲料添加剂在促进畜禽生长、提高饲料利用率、抗病、增加养殖收入等方面效果显著。

3 讨 论

1）通过特殊工艺技术制得的益生菌饲料添加剂含有大量有益菌（其中产朊假丝酵母4.50×109个／g以上、枯草芽孢杆菌6.60×109个／g以上、乳酸乳杆菌3.50×108个／g以上、两岐双歧杆菌1.68×108个／g以上），这些有益菌群在发酵的过程中产生了大量酶，能够促进畜禽肠胃消化和吸收、增加食欲、促进排便，改善饲料的利用效率，提高畜禽生产能力，增加养殖户的经济收入。

2）在饲喂过程中，大量有益菌进入畜禽肠道后，提高了肠道内有益菌的含量，改善了畜禽肠道微生态环境，能有效抑制病原菌的繁殖，使有益菌占优势地位，从而增强畜禽机体免疫力，起到防病、抗病作用。

3）试验中的复合益生菌饲料添加剂的作用原理还需进一步深入研究。