山奈酚诱导人小细胞肺癌H446细胞凋亡及机制

仇 炜，赵 娟，吕雨虹，赵俊霞，王彦玲，雷宇华

(1.北京大学医学部，北京 100191;2.河北医科大学细胞生物学教研室，河北石家庄 050017)

肺癌是我国常见的呼吸系统恶性肿瘤，其中尤以小细胞肺癌的恶性程度最高，严重影响人类的生命健康。山奈酚(kaempferol)属黄酮醇类化合物，主要来源于姜科植物山奈(Kaempferia galanga L)的根茎，具有抗肿瘤、抗氧化及组织保护［1-2］等多种生物活性及药理作用。目前已知，山奈酚对于非小细胞肺癌［3］、卵巢癌［4-5］、前列腺癌［6］、乳腺癌［7］等多种肿瘤均有抑制作用，而山奈酚对人小细胞肺癌是否存在同样的抑制作用目前尚未见报道，因此本实验通过观察山奈酚对人小细胞肺癌H446细胞株增殖及凋亡的影响，探讨其作用机制，旨在为小细胞肺癌的药物治疗及拓展山奈酚的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及设备 试剂山奈酚购自Sigma公司(批号:54608195，纯度 ＞96%)，用 DMSO溶解配制成80 mmol·L-1的储存液，分装，避光保存于-20℃备用;人小细胞肺癌H446细胞购自北京协和细胞资源中心;新生牛血清(newborn calf serum，NCS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI 1640培养基购自美国 Gibco公司，流式细胞仪 FACSTARCalibur(美国Becton Dickinson公司)、倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)、DAPI(美国Invitrogen公司)。p53抗体、bax抗体及bcl-2抗体均购自Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养及分组 H446细胞用含有NCS(体积分数为0.1)的RPMI 1640培养基，置于37℃，5%CO2、饱和湿度环境下进行培养，传代后进行实验。实验分为实验组和对照组，实验组细胞用山奈酚进行处理，对照组细胞用终浓度为0.001(体积分数)的DMSO处理。各组细胞在处理前换用新鲜的含NCS(体积分数为0.01)的RPMI 1640培养基饥饿培养24 h。

1.3 MTT法 取对数生长期的细胞接种于96孔培养板中，每孔加入100 μl(约1×104个细胞)，于37℃，5%CO2、饱和湿度环境下培养，待细胞贴壁后分别加入终浓度为 10、20、40、80 μmol·L-1山奈酚，对照组加入DMSO孵育。分别孵育24、48及72 h后，每孔换用新的培养基并加MTT溶液(5 g·L-1)20 μl，继续孵育 4 h，离心 10 min，弃去上清，每孔加DMSO 150 μl，震荡混匀后用酶标仪测570 nm处的A值。以上各组均设8个复孔。根据下列公式计算抑制率:抑制率/%=［(对照组A﹣实验组A)/对照组A］×100%。

1.4 流式细胞术分析 各组细胞彻底消化，收集细胞后于4℃下500×g离心5 min，用预冷的PBS溶液反复洗涤3次后，置于体积分数为0.7的预冷乙醇溶液中4℃下固定过夜。检测前，于4℃下500×g离心10 min，PBS漂洗2次。将细胞重悬于1 ml碘化丙啶(PI)染液中，于4℃摇床避光染色30 min，筛网过滤后应用流式细胞仪(flow cytometer，FCM)对细胞DNA进行定量分析，检测细胞周期时相分布及凋亡状态。

1.5 DAPI核染色法 用终浓度为20 μmol·L-1的山奈酚处理H446细胞24 h后吸取培养上清，加入多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗细胞3次，加入DAPI(300 nmol·L-1)染液室温染色5 min。PBS洗细胞3次，倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化并照相。

1.6 细胞总蛋白提取和Western blot分析 将各组细胞收集后，用预冷的PBS洗涤3次，加蛋白裂解液将细胞充分裂解。4℃ 8 000 r·min-1离心10 min，收集上清，使用Bradford法蛋白定量。各组均取等量蛋白，经变性处理后，进行SDS-PAGE电泳分离，之后经恒流(300 mA)电转膜(50 min)，50 g·L-1脱脂奶粉封闭，于1∶1 000的一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，1∶5 000稀释的HRP标记的二抗室温孵育1 h。TBS洗膜3次后加入ECL发光液发光拍照。以β-actin为内参，用BIO-RAD图像分析软件对条带灰度值进行定量分析。

2 结果

2.1 山奈酚抑制人小细胞肺癌H446细胞增殖

MTT结果显示，山奈酚作用H446细胞24 h后，当山奈酚浓度≥10 μmol·L-1时细胞增殖活力即被明显抑制(P＜0.05)。用不同浓度的山奈酚(10、20、40、80 μmol·L-1)分别处理 H446 细胞 24、48 及 72 h，该药对H446细胞的抑制率分别为9.8%、25.1%、32.0%、46.2%;16.6%、33.6%、46.6%、68.0%;31.7%、49.0%、58.5%、73.0%;其 IC50值分别为86.6、41.3、24.1 μmol·L-1。以上结果表明，在不同时间点，随山奈酚剂量的增加，H446细胞的增殖活力呈明显降低趋势(P＜0.05)(Fig 1)。

2.2 山奈酚诱导H446细胞阻滞于S期及G2/M期 应用流式细胞术检测药物作用后H446细胞的细胞周期变化，结果发现不同浓度的山奈酚(10、20、40、80 μmol·L-1)处理 H446 细胞 24 h 后，G2/M期细胞所占比例较对照组明显上升，而G0/G1期细胞所占比例明显降低。当山奈酚终浓度为10 μmol·L-1时，S期及G2/M期细胞所占比例较对照组明显增高(P＜0.01)(Fig 2)。以上结果证实，山奈酚可诱导H446细胞阻滞于S期和G2/M期，山奈酚对H446细胞的增殖抑制作用可能与其细胞周期阻滞作用有关。

Fig 1 Effects of kaempferol on H446 cells proliferation(±s，n=8)

Fig 2 Effects of kaempferol on cell cycle in H446 cells(±s，n=3).

2.3 山奈酚诱导H446细胞凋亡，上调p53及bax的表达水平，下调bcl-2的表达水平 细胞经DAPI染色后，倒置荧光显微镜观察可见对照组细胞胞核界限清晰，呈圆形或椭圆形，染色质分布均匀。而山奈酚处理组(20 μmol·L-1)部分细胞胞核缩小，染色质凝集固缩，分布不均(Fig 3)。

Fig 4Effects of kaempferol on apoptosis in H446 cells(±s，n=3)

应用流式细胞仪检测细胞凋亡状态，结果发现不同药物浓度处理细胞24 h后，均出现亚二倍体凋亡峰。各组细胞凋亡率较对照组均有明显升高(P＜0.01)，且随着山奈酚浓度(10、20、40、80 μmol·L-1)的增加，细胞凋亡率呈上升趋势(4.11%、5.38%、8.34%、17.34%)。(Fig 4)。

Western blot结果提示，山奈酚处理H446细胞24 h后，随药物浓度的增加，肿瘤抑制因子p53和凋亡促进蛋白bax的表达水平呈升高趋势，而抗凋亡蛋白bcl-2表达水平则呈下降趋势(Fig 5)。因此提示山奈酚诱导的H446细胞凋亡可能与上调p53及bax表达、抑制bcl-2蛋白表达有关。

3 讨论

近年来，全世界肺癌发病率急剧上升，我国的情况亦不容乐观。肺癌恶性程度较高且起病隐匿，很多患者就诊时已处于晚期，丧失了治疗的最佳时机。小细胞肺癌是恶性程度最高的肺癌，早期即易发生血行及淋巴转移，预后极差，每年由于小细胞肺癌导致的死亡病例占到了全部肺癌的25%左右［8］，严重危害人类的健康。

Fig 5 Effects of kaempferol on expression of p53，bax and bcl-2 in H446 cells

肿瘤细胞凋亡失控是肿瘤发生和发展的重要因素之一。抗肿瘤药物主要通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤内血管形成等方面发挥其抗肿瘤作用。本研究发现，山奈酚可明显抑制人小细胞肺癌H446细胞增殖，促使H446细胞阻滞于S期及G2/M期，诱导该细胞凋亡。p53是重要的肿瘤抑制因子，可通过调节bcl-2家族蛋白功能介导细胞凋亡［9］。凋亡促进蛋白bax及抗凋亡蛋白bcl-2是bcl-2家族中的代表分子，在细胞凋亡的调控过程中也发挥着重要的作用［10］。本研究证实，山奈酚可通过上调H446细胞中p53及bax的表达、下调bcl-2的表达诱导H446细胞凋亡。上述结果提示，山奈酚联合应用细胞周期特异性化疗药治疗小细胞肺癌可能会获得更好的效果。

山奈酚是植物界中广泛存在的一种黄酮醇类化合物。山奈酚在48 h对前列腺癌PC-3细胞和非小细胞癌肺癌A549细胞的IC50值分别为52.1 μmol·L-1［6］和 35 μmol·L-1［3］。本实验中，山奈酚对小细胞肺癌 H446细胞48 h的 IC50值为41.3 μmol·L-1，略高于A549细胞而低于PC-3细胞，提示山奈酚对于小细胞肺癌的敏感性略低于非小细胞肺癌，考虑为细胞来源不同所致。已有研究发现，山奈酚可诱导肿瘤细胞周期阻滞于S及G2/M期，从而抑制人前列腺癌PC-3细胞［6］及人乳腺癌细胞MDAMB-453［7］增殖。另外，山奈酚还可通过上调bax及bad的表达，下调bcl-XL的表达诱导卵巢癌细胞［5］及非小细胞癌肺癌细胞凋亡［3］，推测山奈酚可能有广谱的抗肿瘤效应。因此，长期进食含有山奈酚的食物，对于小细胞肺癌及其他恶性肿瘤的预防亦有重要意义。

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