药品应急检验中如何进行急性毒性试验研究

肖贵南，陈 琪

广东省药品检验所，广东广州 510180

近年来药害事件层出不穷，需要通过药品的应急检验进行质量排查，而预先了解药品的急性毒性情况是十分必要的。在对“齐二药事件”的处理过程中，首先是进行不同厂家同产品之间的急性毒性测定，得出所怀疑的样品其毒性远大于其他厂家同产品的结论，从而启动进一步的应急处理程序，并取得了较好成效[1]。本文着重介绍了在药害事件应急检验中如何进行药品的急性毒性试验（最大耐受量以及半数致死量测定），开展对比试验，为寻找可能产生整体毒性的质量根源，不断缩小排查范围直至找到毒性物质以及药害事件的快速应对方案提供有益的经验。

1 最大耐受量的测定

主要考察实验动物在药物单次给药或24 h内多次给药后的急性毒性情况（不引起动物死亡的最大剂量或浓度）。该方法适合于大多数中药制剂以及部分毒性极小的化学药物，难于测出半数致死量（LD50）的情况。应急检验就是要比较不同厂家同产品之间的最大耐受量情况，从而得出二者毒性不同的结论。

1.1 测定方法

1.1.1 总的原则

从给药浓度（灌胃给药的供试品采用最大溶解度下浓度，注射液采用原液）、给药体积（一般采用0.4 ml/10 g小鼠，必要时可调整至0.5 ml/10 g小鼠）、给药次数（参考样品说明书，一般可接受24 h内给药3次）三方面进行综合考虑，一般应取最大值。

1.1.2 预试验

取健康无孕小白鼠10只，体重18～22 g，雌雄各半，分为两组，试验前禁食12 h，不禁水，试验当天（24 h内）供试品组小鼠灌胃或按规定给药途径给予药液2～3次，给药后连续观察3 d，记录精神状态等一般情况以及小鼠毒性反应情况，试验结束后解剖观察内脏器官有无异常病变。若出现死亡，则可将此剂量作为半数致死量（LD50）的参考剂量之一。

1.1.3 正式试验

根据上述结果，取健康无孕小白鼠60只，体重18～22 g，雌雄各半。试验前禁食12 h，不禁水，实验时按性别、体重将小鼠随机分为3组，分为样品组（包括受试样品及其他厂家同产品各1批）和溶剂对照组。试验当天（24 h内）参照上述给药浓度、给药体积、给药次数的要求进行给药，并计算总给药量，对照组给予等体积溶剂，给药后记录小鼠精神状态等一般情况以及毒性反应情况，由于小鼠若出现死亡一般在给药后第1～3天，同时考虑到应急检验的时效性，观察并计算3 d后小鼠最大耐受量。

1.2 计算公式

该结果表明，小鼠最大耐受量至少在成人日均用量的计算倍数以上，该数值越大，表明供试药品的毒性越小[2]。

2 半数致死量的测定

该方法适合于大多数化学药物以及部分毒性较大的中药制剂，特别是预试验出现小鼠死亡的情况。应急检验的目的是要比较不同厂家同产品之间的半数致死量大小，从而得出二者毒性不同的结论。

2.1 测定方法

2.1.1 预试验

取健康无孕小白鼠若干只，体重18～22 g，试验前禁食12 h，不禁水，实验时按性别、体重将小鼠随机分为若干组（供试品各浓度组及纯化水对照组），每组2～4只，雌雄各半。预试验当天供试品各剂量组（2～10倍稀释）按规定途径给予小鼠药液1次，给药体积为0.4 ml/10 g，对照组小鼠给予等体积溶剂，给药后连续观察3 d，记录精神状态等一般情况以及小鼠毒性反应和死亡情况，试验结束后解剖观察内脏器官有无异常病变。

2.1.2 正式试验

2.1.2.1 剂量的确定 根据上述预试验可得出本品小鼠0～100%死亡剂量，考虑到一定的安全系数，正式试验时可用100%小鼠死亡剂量的1.414倍作为最大剂量，而以0小鼠死亡剂量除以1.414作为最低剂量，在高低剂量之间设置4～6个剂量组，各剂量组的比值一般应相等（一般在0.60～0.85之间）。

2.1.2.2 试验方法 每一个品种测定时取健康无孕小白鼠60只，体重18～22 g，试验前禁食12 h，不禁水，按性别、体重将小鼠随机分为6组（供试品各浓度组及纯化水对照组），每组10只，雌雄各半。试验当天供试品各剂量组按规定途径给予小鼠药液1次，给药体积为0.4 ml/10 g，对照组小鼠灌胃给予等体积溶剂，应急检验给药后连续观察3 d，记录精神状态等一般情况以及小鼠毒性反应和死亡情况。样品的最高与最低剂量组应分别保证有70%～100%和0～30%的死亡率，这样可由Bliss法求得新药小白鼠灌胃给药的半数致死量LD50及其95%的可信区间，该数值越大，表明供试药品的毒性越小[3]。

急性毒性试验的结果可以描述为：采用最大耐受量测定法，测得药品小白鼠灌胃给药或注射给药的最大耐受量为多少；或采用半数致死量测定法（例如Bliss法），测得药品小白鼠灌胃给药的半数致死量LD50及其95%的可信区间为多少。

3 讨论

近年来药害事件的频繁发生，亟需建立相应的应急检验研究方法。与常规检验不同的是，应急检验需要探寻药品事件发生的质量原因，所需检验项目和参考标准也与常规检验存在较大差异（可允许应用经过验证的非标准方法或补充检验方法）。由于导致药害事件的原因复杂多样，因而应急检验除应包括常规检验的全部项目外，还应有辅料、微生物指标以及是否添加其他物质、有毒有害物质等探索性检测的内容。但由于抽样的可疑药品数量相对较少，甚至难于符合常规检验的最低量，如何对尽量少的可疑样品进行探索性研究，快速甄别药品的急性毒性情况，已成为药品应急检验工作者面临的新课题。

药害事件除了伴随患者产生各种不良反应外，出现死亡的个案也不在少数，因而迅速查明样品的急性毒性情况是十分必要的，在我们所经历的“清开灵事件”、“香丹事件”、“肝素钠事件”的应急处理中，急性毒性试验均发挥了重要的作用。具体来说是坚持循证科学思维，以临床出现的各脏器急性毒性症状为中心，从排查动物整体毒性开始，开展对比试验，寻找可能产生整体毒性的质量根源，进而还原分析，不断缩小排查范围，直至找到最终的毒性物质。

在急性毒性试验中，根据受试样品的性质以及预试验结果确定采用最大耐受量测定还是半数致死量测定。由于该方法具有直观、靶向性强的特点，在药害事件的应急处理中往往充当先锋作用，与一般情况下进行的急性毒性试验有所不同。由于药害事件的迅速发生，需要进行快速应对，结合“动物死亡时间多在3 d内”的一般规律，应在给药后采用观察动物3 d，且进行不同厂家同产品之间的急性毒性试验对比，得出所怀疑的样品其毒性远大于其他厂家样品的结论，从而启动进一步应急处理的程序，为药害事件的快速处理奠定良好的基础，实践证明可取得良好成效[4]。

[1]李瑾翡,梁祈,黎旸.“齐二药”亮菌甲素注射液毒性物质筛查研究[J].中国药房,2011,22(5):437-439.

[2]张亚珍,孟文芳,邱丽萍,等.金茵颗粒剂的抗炎作用及最大耐受量的实验研究[J].齐齐哈尔医学院学报,2007,28(11):1282-1283.

[3]李寅超,赵宜红.辛夷挥发油半数致死量(LD50)的测定[J].中国医院药学杂志,2009,29(21):1885-1886.

[4]谢志洁,杨德忠,陈勇,等.亮菌甲素注射液应急检验排查实践研究(一)[J].中国药事,2009,23(3):243-246.