探讨MG132对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响及其机制

朱 逸，贡 力，钮洪艳

徐州医学院附属淮安市第二人民医院心胸外科，江苏淮安 223002

近几十年来，肺癌的发病率和死亡率不断升高。在1998～2002年，肺癌的发病率和死亡率在我国大多数地区居恶性肿瘤的首位[1]；而在2002年肺癌的新病例和死亡人数在全世界也居恶性肿瘤首位[2]。肺癌的病理分型出现腺癌比例增加的趋势。在生物体内蛋白质进行选择性降解的重要途径之一是泛素-蛋白酶体通路（ubiquitin proteasome pathway，简称UPP通路），它在调节细胞凋亡过程中的作用非常重要[3-4]，在研究UPP在细胞凋亡中的作用时，蛋白酶体抑制剂（MG132）的应用为我们提供了有力的手段。有研究表明，蛋白酶体抑制剂能够诱导多种人肿瘤细胞的凋亡是通过阻断泛素化通路而实现，但其具体作用机制到目前仍未被阐明[5-6]。该研究应用体外培养的人肺腺癌细胞株A549，并且给予不同浓度的MG132处理，观察其对A549细胞凋亡率的影响，以及细胞内Bcl-2和Bad蛋白表达水平的变化。探讨MG132调控A549细胞凋亡的可能机制，为进一步研究MG132诱导A549凋亡的机制和其他类型肺癌以及其他肿瘤的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 A549细胞和试剂

人肺腺癌细胞株A549购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。新生牛血清（NBS，杭州四季青生物工程材料研究所）；RPMI-1640 培养基（Gibco公司）；AnnexinVFITC/PI凋亡试剂盒（上海博蕴生物试剂有限公司）；MG132、一抗 Bcl-2 和 Bad、MTT（Sigma公司）。

1.2 细胞培养及处理

将A549细胞常规复苏后，以RPMI-1640培养液加10%NBS培养，放入37℃、5%CO2的培养箱内培养，细胞传2～3代后按照需要接种于不同培养板中，当细胞融合密度约70%时，换无血清的RPMI-1640培养液培养，MG132在给药前应用RPMI-1640培养液现配。并且进一步稀释使其在培养液中的终浓度为：0、5、10、20、40 μmol/L，并设空白对照组（不做任何处理）。培养24 h，检测相关指标。

1.3 MTT比色法检测细胞存活率

细胞按照需要接种于96孔板，处理方法同“1.2”所述，将培养24 h后的每组细胞，每孔中加入MTT 20 μl（PBS配制、5 g/L）。4 h后终止培养，吸弃所有液体，再加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）200 μl充分溶解，静置于 37℃条件下30 min。用酶标仪测定570 nm光密度（OD）值，计算细胞存活率 （即每组OD值/正常对照组OD值×100%＝该组的细胞存活率）。

1.4 蛋白免疫印迹（Western Blot）

将传代后细胞接种于培养瓶内，处理同方法“1.2”所述。培养24 h后收集细胞，应用胞浆蛋白抽提试剂盒提取蛋白，测蛋白后分装，保存于-80℃冰箱中备用。将等量蛋白以10%聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，半干转法至NC膜上，随后经5%脱脂奶粉封闭，室温下1 h，加入稀释的一抗Bcl-2（1∶300）和 Bad（1∶300），4℃条件下过夜。第 2 日晨复温 30 min，常规方法洗膜，NBT/BCIP显色，双蒸水洗膜终止反应。应用图像处理仪（Gene Company）扫描结果，Image J软件进行半定量分析。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率

细胞传代后接种于6孔板，处理方法同“1.2”所述。培养24 h，吸尽培养基，用胰蛋白酶（0.25%）消化细胞后收集，磷酸盐缓冲液（PBS）液洗2次，每组细胞收集为1管，每管加入凋亡试剂盒中的结合缓冲液将细胞重悬，随后将细胞转移到试管中。每管再分别加入10 μl的PI和5 μl的Annexin VFITC。避光，室温放置5 min，流式细胞仪检测细胞的凋亡率。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，Sigma Plot 2000作图。计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用最小显著差（LSD-t）法，以P<0.05为差异有统计学意义。每组数据至少从3次独立的实验中获得。

2 结果

2.1 MG132对A549细胞成活率的影响

MTT法检测结果显示，随着MG132浓度的增加A549细胞存活率逐渐下降（表1），呈现浓度依赖性关系。并且，与正常对照组比较，除了0 μmol/L组外，其余各组差异均有统计学意义（均 P＜0.05）。

2.2 MG132对A549细胞凋亡率的影响

Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测结果显示，空白对照组 A549 细胞凋亡率约（4.0±1.4）%，0 μmol/L 组凋亡率为（4.1±1.7）%、5 μmol/L 组凋亡率为（12.2±2.1）%、10 μmol/L组凋亡率为 （26.3±2.9）%、20 μmol/L 组凋亡率为 （33.1±3.0）%、40 μmol/L 组凋亡率为（54.2±4.7）%，与空白对照组比，除0 μmol/L组外，其余各组差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.3 MG132对A549细胞中Bcl-2和Bad蛋白的影响

Western Blot结果显示，随着MG132的浓度增高A549细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达逐渐降低（图1A），除0 μmol/L组外，其余各组与空白对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。而促凋亡蛋白Bad的表达在各组中无明显变化（图1B）。与空白对照组比，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

图1 Western Blot检测细胞内Bcl-2和Bad蛋白的表达

3 讨论

泛素-蛋白酶体通路[7]（UPP）调控着真核生物细胞内绝大部分蛋白质的降解过程，参与细胞转录、蛋白质稳定、蛋白质降解、细胞凋亡、应激反应和受体胞吞等多种生理过程，能够通过多种途径影响细胞周期的进行，是真核细胞内重要的蛋白质质控系统。MG132[8]（Z-Leu-Leu-Leu-CHO，三肽基乙醛）可以抑制UPP途径介导的蛋白质降解，是一种常用的肽醛类26S蛋白酶体抑制剂，如影响NF-κB、调节细胞内凋亡信号通路、调节细胞周期相关蛋白和凋亡调控蛋白等过程，从而抑制细胞的增殖促进细胞凋亡，是很有发展前途的抗肿瘤药物。也有研究表明：与凋亡调控相关的Bcl-2家族、caspase和凋亡抑制因子等的降解均与UPP有关[9-10]。在本研究中笔者特别关注Bcl-2家族在UPP通路中的作用，在细胞凋亡调控机制方面，Bcl-2是迄今研究最广泛而深入的凋亡调控基因之一，在细胞凋亡中起着非常重要的作用，Bcl-2能够抑制细胞凋亡，而Bad则促进细胞的凋亡，是该家族中两组作用相反的蛋白。本研究应用体外培养的A549人肺腺癌细胞，给予不同浓度蛋白酶体抑制剂MG132处理一段时间后，检测细胞凋亡率的变化，同时观察对细胞中Bcl-2和Bad两种蛋白表达水平的影响，初步探讨在A549细胞凋亡中UPP通路的作用及其可能的机制。

该研究结果显示，随着MG132浓度增加A549细胞的凋亡率逐渐增加，并且细胞中Bcl-2蛋白的表达水平也逐渐降低。同时在笔者的实验中也发现，Bad蛋白的表达水平在各目前仍存在争议。有学者基于Graves甲亢患者的免疫损伤，建议首选泼尼松治疗，小剂量应用2～3周后再行ATD治疗。Graves甲亢初期即可出现白细胞减少和肝功能受损，ATD治疗会加重肝损害和白细胞降低，甚至导致粒细胞缺乏。多数学者认为，ATD致免疫功能紊乱是导致粒细胞缺乏的重要原因。免疫介导对肝损害起着重要的作用，从本质上讲，肝损害也是自身免疫损害的一部分[11]。鉴于上述原因，笔者认为在严重甲亢、肝功能损害、白细胞减少、皮肤过敏时，应在使用ATD的同时，小剂量短期加用泼尼松，并且应定期复诊，密切监测患者不良反应。

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