1HNMR研究苯甲酸钠、维生素C及葡萄糖与蛋白质的结合部位

李 磊，刘雪锋，阮小云，赵英杰

(1.中国石油集团石油职业卫生技术服务中心，河北 廊坊 065000；2.江南大学化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122；3.廊坊师范学院管理学院，河北 廊坊 065000)

选取典型防腐剂、维生素以及葡萄糖，开展与生物体重要运输蛋白和消化酶相互作用研究，可以从分子层面提供生理安全等方面的重要信息[1，2]。苯甲酸钠(Sodium benzoate，SB)(图1A)是最常用的食品、药物防腐剂。维生素C(Vitamin C，VC)(图1B)是人体必需的重要维生素，是食品、饮料等常用营养添加剂之一。葡萄糖(Glucose，Glu)(图1C)是生物体必需的基础营养和能源物质，是食品和医药行业的重要基础原料。血清白蛋白是生物体血浆中含量最丰富的蛋白质，能与许多内源和外源物质可逆结合[3，4]，是最重要的运输蛋白；胃蛋白酶(Pepsin)是胃液中最重要的消化蛋白酶。SB与牛血清白蛋白(BSA)之间的结合已有报道[5]，但具体结合部位不明确；尚未见到SB与Pepsin以及VC、葡萄糖与BSA、Pepsin结合部位的相关报道。

作者采用核磁共振(1HNMR)波谱技术研究了SB、VC、葡萄糖分别与BSA和Pepsin相互结合的主要部位，对分子间的作用方式进行了理论推测。

图1 苯甲酸钠(A)、VC(B)和葡萄糖(C)的分子结构

1 实验

1.1 试剂和仪器

牛血清白蛋白(>98%，BSA FractionⅤ)，上海华美生物工程公司；胃蛋白酶(生化试剂)、苯甲酸钠(分析纯)、L(+)维生素C(分析纯)、α-D-葡萄糖(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；重水(分析纯)，北京化学试剂公司。

ARX-300型核磁共振仪，瑞士Bruker公司。

1.2 方法

20℃时以D2O为溶剂，首先测定小分子物质的1HNMR谱，然后加入一定量的蛋白质，测定小分子物质-蛋白质溶液的1HNMR谱，以D2O(化学位移δ=4.70 ppm)为内标确定各H原子化学位移。

2 结果与讨论

2.1 苯甲酸钠与蛋白质的结合部位

图2为SB、SB-BSA和SB-Pepsin的1HNMR谱，其中SB-Pepsin1HNMR谱中未标出的信号为Pepsin的1HNMR信号，谱图解析结果列于表1。

图2 SB、SB-BSA、SB-Pepsin的1HNMR图谱

表1 SB、SB-BSA、SB-Pepsin的化学位移值δ及改变量Δδ

由表1可见，分别加入BSA和Pepsin后，SB各H原子化学位移均略向低场移动，表明SB与BSA和Pepsin能够互相结合[6]。这种结合属于非化学键物理结合，因此，SB分子中各H化学位移改变幅度不大；此外，由于SB为水溶性物质，因此在蛋白质分子中SB的结合部位不可能是蛋白质分子的疏水空腔区域，而应该在临近蛋白质分子表面的亲水区域层。结合在蛋白质亲水区域层的SB分子的羧酸阴离子应该与蛋白质的亲水阳离子之间存在静电相互作用，尽管1HNMR结果难以给出静电相互作用的证据，但从理论上推测，SB与蛋白质分子间的静电相互作用是可能的。1HNMR结果显示SB分子中苯环上H原子化学位移均向低场移动，说明SB与蛋白质结合的主要部位为SB分子的苯环片段[6]。SB与BSA和Pepsin结合后，水对SB溶剂化作用有所减弱，从而使SB苯环上电子云密度略微降低，SB苯环H化学位移应该向低场移动；同时，SB与蛋白质分子结合后，SB的苯环能够与BSA和Pepsin的芳香性氨基酸残基的芳香环之间发生π-π电子堆积作用[7]，环电流对SB苯环上的H原子去屏蔽效应增强，SB苯环H化学位移向低场移动[8]。

需要指出的是，与Pepsin结合后SB苯环H原子化学位移改变幅度相对较大，其原因可能是BSA和Pepsin分子结构存在明显差异。BSA分子中α-螺旋结构含量比Pepsin多，而β-折叠、Turn结构含量相对较少[9～11]，因此，BSA分子结构相对规整且紧密，而Pepsin分子结构较松散，导致SB苯环更加接近Pepsin芳香性氨基酸残基的芳香环，两者之间的π-π作用更强。

2.2 VC与蛋白质的结合部位

图3为VC、VC-BSA和VC-Pepsin的1HNMR谱，谱图解析结果列于表2。

图3 VC、VC-BSA、VC-Pepsin的1HNMR图谱

表2 VC、VC-BSA、VC-Pepsin的化学位移值δ及改变量Δδ

由表2可见，分别加入BSA和Pepsin后，VC分子中乙二醇支链片段H原子化学位移均向低场方向移动，说明VC与BSA和Pepsin的结合部位是VC分子中乙二醇支链片段。VC为非电解质，分子结构中富含高电负性O原子，因此，从理论上推断VC分子与BSA、Pepsin之间应该存在分子间氢键作用。VC分子与BSA和Pepsin分子结合后，VC-Ha、VC-Hb、VC-Hc和VC-Hd与溶剂水之间的分子间氢键数目减少，H原子周围电子云密度降低，去屏蔽效应增强，其化学位移向低场方向移动，属于热力学熵驱动过程。与SB的结合情况类似，与Pepsin结合后VC分子中乙二醇支链片段H原子化学位移改变幅度相对较大，这可能也是BSA和Pepsin分子结构差异所导致的。

2.3 葡萄糖与蛋白质的结合部位

图4为Glu、Glu-BSA和Glu-Pepsin的1HNMR谱，谱图解析结果列于表3。

图4 葡萄糖、葡萄糖-BSA、葡萄糖-Pepsin的1HNMR图谱

表3 葡萄糖、葡萄糖-BSA、葡萄糖-Pepsin的化学位移值δ及改变量Δδ

由表3可见，葡萄糖分子H原子的化学位移在分别加入BSA和Pepsin后均向低场方向移动，说明葡萄糖是以整个分子与BSA、Pepsin互相结合。葡萄糖是多羟基非电解质，与VC类似，葡萄糖的-OH也应该与BSA、Pepsin分子间存在分子间氢键作用。但是与BSA、Pepsin结合后，葡萄糖与溶剂水分子间氢键数目减少，使葡萄糖分子中Glu-Ha和Glu-Hb原子周围电子云密度降低，去屏蔽效应增强，其化学位移向低场方向移动。与Pepsin结合后，Glu-Ha化学位移改变幅度相对较大，其原因与SB、VC相类似；但Glu-Hb化学位移改变幅度反而减弱，这可能是由于Pepsin分子肽链比BSA短，不足以有效包裹葡萄糖分子，即与Pepsin结合时葡萄糖Glu-Hb部分暴露于水相。

3 结论

SB与BSA、Pepsin的结合部位为SB分子中的苯环片段，除静电相互作用外，主要以芳香环间π-π电子堆积作用方式相互结合。VC与BSA、Pepsin的结合部位为VC分子结构的乙二醇支链片段，而葡萄糖则以整个分子与BSA、Pepsin结合；VC、葡萄糖主要以分子间氢键方式与BSA、Pepsin结合。3种物质分子与BSA和Pepsin结合部位H原子的化学位移改变幅度不大，推测3种物质分子在蛋白质分子上的结合部位可能处于临近蛋白质分子表面的亲水区域层。

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