双水相体系萃取木瓜蛋白酶的研究

乐 薇，陆志强

(中南民族大学工商学院 环境与生命科学系，湖北 武汉 430065)

木瓜蛋白酶是从木瓜的乳汁中提取精制而成的纯天然酶制品，能将大分子蛋白质水解成肽或氨基酸，可制成肉类嫩化剂，具有助消化、消炎、利胆、止痛等药效，应用范围广泛[1～3]。双水相萃取条件温和，成品活性损失小，处理量大，分离步骤少，无有机溶剂残留，设备投资省，操作简单，易于工程放大和连续操作[4～6]。

鉴于此，作者在此采用双水相体系萃取木瓜蛋白酶，对萃取过程的主要影响因素进行研究，以期寻找有效的萃取高活性木瓜蛋白酶的方法。

1 实验

1.1 试剂与仪器

硫酸铵、95%乙醇、85%磷酸，分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司；磷酸氢二钠，分析纯，天津市塘沽区德华化学试剂厂；三氯乙酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸二钠，分析纯，上海化学试剂公司；PEG4000，化学纯，天津市光复精细化工厂研究所；干酪素，生化试剂，北京博星生物技术有限公司；L-酪氨酸，北京华绿渊生物有限公司；盐酸半胱氨酸盐、考马斯亮蓝G-250、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白，武汉贝宁生物技术公司。

752型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；PHS-25型数字酸度计，上海理达仪器厂；HH-2型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 双水相体系萃取木瓜蛋白酶

配制一定pH值的一系列PEG/(NH4)2SO4双水相溶液，分别加入相同体积的原酶液，室温下在漩涡混匀器上混合3 min后，静置30 min，待其自然成相后，使体系上下相分离完全。测定上下相体积、下相蛋白质的含量及酶活力，依酶活力回收率及总蛋白分配系数选择适宜相对分子量的PEG进行后续实验，考察其质量分数及pH值对木瓜蛋白酶萃取的影响。酶活力回收率及总蛋白分配系数依下式计算：

酶活力回收率=下相酶活力/原酶液酶活力

总蛋白分配系数=下相总蛋白浓度/上相总蛋白浓度

1.2.2 相图的绘制

准确称取质量分数为40%的PEG4000原液于试管中，加入质量分数为40%的(NH4)2SO4原液，混合，直至出现浑浊为止，计量加入(NH4)2SO4的量；再计量加入适量水，使体系澄清；并继续加入(NH4)2SO4，使体系再次变浑浊；如此反复操作，按下式计算达到浑浊时PEG4000和(NH4)2SO4在系统中的质量分数，绘制PEG4000/(NH4)2SO4双水相体系的相图。

式中：P为某成相点时PEG4000在系统中的总量(g)；Q为某成相点时硫酸铵在系统中的总量(g)；W为某成相点时水在系统中的总量(g)；X为某成相点时PEG4000占总量的百分数(%)；Y为某成相点时硫酸铵占总量的百分数(%)。

1.3 蛋白质含量的测定[7]

以牛血清白蛋白作为标准，参照考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。

1.4 酶活力的测定[1]

取适量待测酶液，加入0.25 mL激活剂(0.1 mol·L-1pH值7.2的磷酸缓冲溶液，含36 mmol·L-1半胱氨酸、0.6 mmol·L-1EDTA)和2.3 mL 0.1 mol·L-1pH值7.2的磷酸缓冲溶液，于37℃预热10 min；加入37℃预热的1%酪蛋白溶液0.5 mL，37℃下恒温水浴反应10 min；然后加入1.0 mL 20%三氯乙酸溶液终止酶反应。对照管先加20%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。过滤，取其上清液于波长275 nm处测定吸光度。

酶活力单位定义：37℃下，木瓜蛋白酶水解酪蛋白每分钟产生1 μg酪氨酸的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

2 结果与讨论

2.1 PEG相对分子量对木瓜蛋白酶萃取效果的影响

固定PEG质量分数为8%、(NH4)2SO4质量分数为20%，考察PEG相对分子量对木瓜蛋白酶萃取效果的影响，结果见图1。

图1 PEG相对分子量对木瓜蛋白酶萃取效果的影响

由图1可知，随着PEG相对分子量的增加，木瓜蛋白酶的分配系数和酶活力回收率均呈下降趋势。其中PEG2000和PEG4000相比，木瓜蛋白酶的分配系数和酶活力回收率差别不是很大，但从聚合物使用量和成本考虑，PEG分子量越低，成相所需(NH4)2SO4和PEG的质量分数就愈高，成本也就愈高。因此，确定采用PEG4000进行后续实验。

2.2 双水相相图

按1.2.1绘制相图，结果见图2。

图2 PEG4000/(NH4)2SO4双水相相图

由图2可知，(NH4)2SO4和PEG4000质量分数达到一定时才可以形成两相，在节线的上方区域都可以形成双水相，以下操作所选择的点均在相图上方。

2.3 PEG4000质量分数对木瓜蛋白酶萃取效果的影响

固定(NH4)2SO4质量分数为20%，考察PEG4000质量分数对双水相体系萃取木瓜蛋白酶的影响，结果见图3。

图3 PEG4000质量分数对木瓜蛋白酶萃取效果的影响

由图3可知，当(NH4)2SO4质量分数一定时，随着PEG4000质量分数的增加，木瓜蛋白酶的酶活力回收率及分配系数也相应增大；但PEG4000质量分数大于6%时，酶活力回收率及分配系数反而下降。这是因为，当(NH4)2SO4质量分数一定时，随着PEG4000质量分数的增加，系统远离临界点，有利于目标蛋白富集于其中一相；但当PEG4000质量分数增大到一定程度时，成相物质分子间的作用增大，相界面张力亦增大，系统粘度也会增大，溶质在相间的传递和在相内的扩散阻力大大增加，反而不利于目标蛋白分子进入此相。因此，确定PEG4000质量分数为6%。

2.4 (NH4)2SO4质量分数对木瓜蛋白酶萃取效果的影响

固定PEG4000质量分数为6%，考察(NH4)2SO4质量分数对双水相体系萃取木瓜蛋白酶的影响，结果见图4。

图4 (NH4)2SO4质量分数对木瓜蛋白酶萃取效果的影响

由图4可知，当PEG4000质量分数一定时，随着(NH4)2SO4质量分数的增加，酶活力回收率及分配系数也相应增大；但(NH4)2SO4质量分数大于18%时，酶活力回收率及分配系数反而下降。这是因为，(NH4)2SO4质量分数对分配系数的影响主要表现在对相间电位和蛋白质疏水性的影响；(NH4)2SO4质量分数过高会影响蛋白质的表面疏水性，使酶产生盐析作用，从而使分配系数下降。因此，确定(NH4)2SO4质量分数为18%。

2.5 pH值对木瓜蛋白酶萃取效果的影响

pH值会影响蛋白质在两相中的分配行为。固定PEG4000质量分数为6%、(NH4)2SO4质量分数为18%，考察pH值对双水相体系萃取木瓜蛋白酶的影响，结果见图5。

由图5可知，随着pH值的增大，木瓜蛋白酶的酶活力回收率及分配系数先增大后减小，pH值为6.0时最有利于酶的萃取，酶活力回收率和分配系数均达到最大，分别为80.25%和8.1。因此，确定pH值为6.0。

图5 pH值对木瓜蛋白酶萃取效果的影响

3 结论

采用PEG4000/(NH4)2SO4双水相体系萃取木瓜蛋白酶，当PEG4000质量分数为6%、(NH4)2SO4质量分数为18%、pH值为6.0时，木瓜蛋白酶的萃取效果最好，酶活力回收率为80.25%，分配系数达8.1。

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