大鼠在体肠灌注研究五味子有效成分肠吸收

贝 煜，于 洋，黎同明

（广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006）

五味子为木兰科植物Schisandra chinensis（Turcz.）Baill的干燥成熟果实，习称“北五味子”，性温，味酸、甘，为常用收涩药，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，用于久咳虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗、盗汗、津伤口渴、短气脉虚、内热消渴、心悸失眠等症状。五味子的主要活性成分为木脂素类，如五味子醇甲（schisandrol A）、五味子酯甲（Schisantherin A）、五味子甲素（schisandrin A）和五味子乙素（schisandrin B）等［1］。现代研究表明，五味子主要活性成分具有显著的保肝作用及逆转P－gp所介导的肿瘤多药耐药性。虽然对其药代动力学研究的相关文献报道很多，但是对五味子木脂素的在体肠吸收机制研究鲜见报道。本文以北五味子为模型药物，以主要活性成分五味子醇甲，甲素、乙素、酯甲为研究对象，建立适用于五味子木脂素吸收研究的大鼠原位灌注模型、研究五味子木脂素在不同浓度下以及在P－gp抑制剂共同作用下的吸收差异。为今后五味子口服制剂的研究提供依据。

1 实验材料

1.1 仪器

HL－2恒流蠕动泵（上海精科实业有限公司）；岛津LC－2010C型高效液相色谱仪，SPD－M10AVP型二极管阵列检测器，Shimadzu’LC solution色谱工作站（日本岛津公司）；722s可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；恒温水浴锅（江苏金坛金城国胜实验仪器厂）；RE－52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 药品及试剂

五味子药材（广州致信中药饮片有限公司，批号：091020，产地：吉林）；五味子醇甲标准品（中国药品生物制品检定所，批号：110857－201010）；五味子酯甲标准品（中国药品生物制品检定所，批号：111529－200503）；五味子甲素标准品（中国药品生物制品检定所，批号：110764－201010）；五味子乙素标准品（中国药品生物制品检定所，批号：110765－200710）；维拉帕米（上海医药有限公司信谊制药总厂）；水合氯醛（天津百世化工有限公司）；酚红（天津市化学试剂研究所）。甲醇为色谱醇，其余试剂均为分析醇。

1.3 动物

SD大鼠，体重（250±30）g，由广州中医药大学实验动物中心提供。

2 实验方法

2.1 五味子醇提物的制备

取五味子药材干燥粉碎，过65目筛，得五味子粉末。精密称取五味子粉末100g，用10倍量60%的乙醇加热回流提取两次，每次1h。合并提取液，静置过滤，减压回收乙醇，真空干燥后备用。

2.2 溶液的配制

Krebs－Ringer，s（K－R）：称取 NaCl 7.8g，KCl 0.35g，CaCl20.37g，NaHCO31.37g，NaH3PO40.32g，MgCl20.02g，葡萄糖1.4g，蒸馏水定容至1L，即得到pH7.4的KR液。空白循环液：K－R液进行大鼠肠循环灌注3h，即得。酚红K－R液：精密称取酚红20mg，置1000mL容量瓶中，加K－R液溶解，稀释定容至刻度，摇匀，得到浓度为20μg·mL－1的酚红 K－R液。

2.3 大鼠原位肠循环灌注模型的建立［2］

取实验前禁食12h（自由饮水）的SD大鼠，腹腔注射水合氯醛0.35mL·100g－1，麻醉后固定。沿腹中线打开腹腔（约2.5cm），结扎胆总管，在实验肠管两端各切一小口，在上端小口处插入直径为0.3cm的玻璃管，并用线扎紧。用注射器将（37±0.5）℃的生理盐水缓缓注入肠管，洗去肠管内容物至净。然后在实验肠管下端小口处插入玻璃管，并用线扎紧。将肠管两端的玻璃管与蠕动泵的胶管连接，形成回路，开动蠕动泵。以5mL·min－1流速循环10min后，将流速调节为2.5mL·min－1，立即自装有灌注液的锥形瓶中取样1mL，作为测定零时间药物浓度和酚红浓度的样品，另向锥形瓶中补加酚红K－R液lmL，其后每隔20min亦按同法取样并补加酚红K－R液，循环3h后，中止实验。

2.4 原位肠灌注实验法中参数计算［3］

吸收速率常数（Ka）：以小肠内剩余药量的对数（lnX）对取样时间t作图，得到一直线，从直线斜率可求吸收速率常数Ka（h－1）：Ka＝（InX0－InX）／t。表现渗透系数Papp：药物透过胃肠道粘膜的表观渗透系数Papp，单位为cm·s－1。A为小肠吸收面积（cm2）。Papp＝Ka／A／3600。

2.5 灌流液中酚红浓度的测定

由于肠灌流的过程中不但有水的吸收，还有水的分泌，导致循环液的体积发生变化，通过对酚红浓度的测定来校正水的吸收。用空白肠灌流液加入酚红配制浓度为10.2、20.4、40.8、61.2和81.6μg·mL－1等一系列标准液，取上述不同浓度的酚红溶液各0.5mL，加入4.5mL 1.0mol·L－1的NaOH溶液显色，于400～800nm波长范围内进行扫描，在558nm处酚红有最大吸收，因此于558nm处测定酚红的吸光度。以吸光度A为纵坐标（Y）、酚红浓度（μg·mL－1）为横坐标（X），绘制标准曲线。

2.6 灌流液中五味子4种有效成分浓度的测定

色谱条件：色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；Phenomenex C18预柱；流动相：A 为甲醇，C为水（65∶35v／v）；梯度洗脱：0～40min，65%～90%，40～45min，90%～65%；45～50min，A为65%，C为35%；流速为1mL·min－1，柱温为35℃，检测波长为235nm，进样量为50μL。对照品溶液的制备：分别精密称取五味子醇甲，五味子酯甲，五味子甲素，五味子乙素对照品0.00220g，0.00159g，0.00126g，0.00145g，置于100mL容量瓶中，加入酚红 K－R液－甲醇（1∶1，V／V），定容至刻度。得到混合对照品溶液。供试液的制备：精密称取五味子醇提物干膏1g，置于锥形瓶中，加入2.5mL DMSO和2.5mL无水乙醇超声溶解，得到五味子醇体液储备液。分别取五味子醇体液储备液0.5mL，1mL和2mL，置于容量瓶中，加入酚红 K－R液，超声溶解，并稀释定容到刻度，摇匀，使五味子醇提物的浓度为1mg·mL－1、2mg·mL－1和4mg·mL－1。样品的处理：精密吸取肠灌流液0.5mL，加0.5mL甲醇，涡旋混合1min，过0.45μm微孔滤膜。在上述色谱条件下进行分析。标准曲线的制备：精密吸取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素混合对照品储备液适量，按倍数稀释法，用K－R溶液：甲醇（1∶1，V／V）溶液稀释，得到一系列标准工作液。在上述色谱条件下进样测定，记录色谱图，以浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。

2.7 稳定性实验

2.7.1 五味子4种有效成分在K－R液中的稳定性考察

用空白肠灌流液配制浓度为2mg·mL－1的五味子醇提取物，置于密闭容器中，37℃水浴3h，分别于0、1、2、3h取样，测定五味子醇提取物中4种有效成分的含量，并计算其剩余百分率（）。

2.7.2 五味子4种有效成分在不同pH值K－R液中的稳定性考察

用1.0mol·L－1HCl和NaOH溶液调节空白K－R液到不同的pH值分别为5.01、6.84和7.97.然后分别用这3种pH值的K－R液配制浓度为2mg·mL－1的五味子醇提取物作为供试液，置于密闭容器中，于37℃水浴中放置3h，分别于0、1、2、3h取样测定五味子提取物中4种有效成分的浓度，并计算其剩余百分率（）。

2.8 五味子总木脂素不同剂量组大鼠的吸收研究

用酚红 K－R液分别配制浓度为1mg·mL－1、2mg·mL－1和4mg·mL－1五味子醇提物作为供试品溶液。取SD大鼠15只，随机分成三组，按照“2.1”的实验步骤进行操作，结扎胆管后，自十二指肠上部及回盲肠末端插管，分别用供试液1、2、3进行原位肠循环灌注，定时取样，测定各时间点的五味子甲素、乙素、醇甲、酯甲的浓度，然后按照“2.4”计算其 Ka、Papp。

2.9 P－gp抑制剂对五味子总木脂素肠吸收机理和吸收调控的研究

用酚红K－R液分别配置浓度为2mg·mL－1五味子醇提物作为对照组溶液，加入维拉帕米（0.1mg·mL－1）作为供试品溶液。取SD大鼠15只，随机分成三组，分别考察小肠的吸收。按照“2.3”的实验步骤进行操作进行原位肠循环灌注，定时取样，测定各时间点的五味子甲素、乙素、醇甲、酯甲的浓度，然后按照“2.4”计算其 Ka、Papp。

3 实验结果

3.1 灌流液中酚红浓度的测定

以吸光度A与酚红浓度C（μg·mL－1）进行线性回归，得酚红测定的标准曲线为：Y＝0.0162X＋0.0255，r＝0.9999（n＝5），线性范围为10.20～81.6μg·mL－1，RSD为0.68%，平均回收率为100.1%。

3.2 灌流液中五味子4种有效成分浓度的测定

图1 肠灌流液中4种有效成分的HPLC色谱

五味子醇甲：Y＝201524X＋33188，r＝0.9997，线性范围为0.088～22.000μg.mL－1；五味子酯甲：Y＝318516X＋14207，r＝0.9998，线性范围为0.064～15.900μg.mL－1；五味子甲素：Y＝223174X＋10514，r＝0.9998，线性范围为0.050～12.600μg.mL－1；五味子乙素：Y＝ 203827X＋6826.2，r＝0.9998，线性范围为0.029～14.500μg.mL－1。五味子醇甲、酯甲、甲素、乙素的平均回收率分别为（100.56±2.08）%、（99.03±1.78）%、（100.59±1.49）%和（98.28±1.42）%，RSD分别为为2.06%、1.80%、1.48%和1.44%。以上结果表明，五味子木脂素4种有效成分在各自浓度范围内呈良好线性关系并具有较好的回收率。

3.3 稳定性实验

3.3.1 五味子4种有效成分在K－R液中的稳定性考察

浓度为1mg·mL－1、2mg·mL－1和4mg·mL－1的五味子提取物在空白大鼠肠灌流液中的稳定性见表1，结果显示，高、中、低3个浓度的五味子提取物中4种有效成分在空白肠灌流液中3h内基本稳定。

表1 五味子4种有效成分在37℃灌流液中的稳定性（n＝3，）

表1 五味子4种有效成分在37℃灌流液中的稳定性（n＝3，）

五味子醇甲 五味子酯甲 五味子甲素 五味子乙素高剂量组 99.57±0.8199.17±1.63101.67±1.67100.01±1.65中剂量组 99.09±0.9199.67±0.77101.10±1.17101.10±1.91低剂量组 99.82±1.55101.96±1.47100.37±0.9799.33±0.82

3.3.2 五味子4种有效成分在不同pH值K－R液中的稳定性考察

表2 五味子4种有效成分在不同pH值灌流液中的稳定性（n＝3，）

表2 五味子4种有效成分在不同pH值灌流液中的稳定性（n＝3，）

五味子醇甲 五味子酯甲 五味子甲素 五味子乙素5.0199.27±1.2698.00±2.0498.46±1.5699.47±0.566.4899.38±0.6998.32±1.4298.37±1.5199.27±0.627.9799.24±0.5498.80±2.15100.90±0.79100.42±0.64

浓度为2mg·mL－1的五味子提取物在不同pH值的空白大鼠肠灌流液中的稳定性见表2，结果显示，五味子提取物中4种有效成分在pH值为5.01～7.79范围内的空白肠灌流液中3h内基本稳定。

3.4 五味子总木脂素不同剂量组大鼠的吸收研究

表3 五味子高中低剂量组灌流液中4种有效成分的肠吸收的Ka和Papp值（n＝5，）

表3 五味子高中低剂量组灌流液中4种有效成分的肠吸收的Ka和Papp值（n＝5，）

五味子醇甲 五味子酯甲 五味子甲素 五味子乙素高剂量组 Ka 0.137±0.018 0.297±0.034 0.458±0.087 0.47 S 0.174中剂量组 Ka 0.126±0.032 0.303±0.092 0.449±0.080 0.396±0.031 Papp×10－6cm·sec－1 0.317±0.079 0.766±0.233 1.133±0.203 1.169±0.203低剂量组 Ka 0.127±0.035 0.284±0.081 0.438±0.188 0.390±0.043 Papp×10－6cm·sec－1 0.319±0.088 0.717±0.206 1.107±0.048 1.086±0.1089±0.069 Papp×10－6cm·sec－1 0.344±0.045 0.751±0.085 1.156±0.219 1.210±

3.5 P－gp抑制剂对五味子总木脂素肠吸收研究

表4 P－gp抑制剂后五味子4种有效成分的肠吸收的Ka和Papp值（n＝5，）

表4 P－gp抑制剂后五味子4种有效成分的肠吸收的Ka和Papp值（n＝5，）

注：＊P＜0.05vs control of Ka；△P＜0.05vs control of Papp。

五味子醇甲 五味子酯甲 五味子甲素 五味子乙素维拉帕米 Ka 0.143±0.022 0.434±0.126＊ 0.437±0.035＊ 0.429±0.014＊Papp×10－6cm·sec－1 0.340±0.055 1.097±0.318△ 1.106±0.088△ 1.081±0.033△0.083对照组 Ka 0.166±0.035 0.310±0.074 0.336±0.031 0.363±0.024 Papp×10－6cm·sec－1 0.420±0.088 0.784±0.187 0.879±0.097 0.929±

由以上各表可知，五味子4种有效成分，在考察的浓度范围以内，浓度增加一倍，吸收速率（Ka）和表观渗透系数（Papp）却没有显著性差异（P＞0.05），并不符合Fick s方程。这提示在所考察的浓度范围内五味子4种有效成分不只是单纯的被动扩散，而是存在载体媒介转运方式。加入P－gp抑制剂维拉帕米（VP）与正常组相比，五味子酯甲、甲素和乙素这三种有效成分的吸收速率常数（Ka）和表观渗透系数（Papp）都显著增加（P＜0.05）。这种促进吸收的效果是通过抑制P－gp的外排而起作用的，提示五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素是P－gp的底物。

4 讨论

药物的口服吸收是一个复杂的动态过程，其中透膜过程是关键。药物透膜过程主要有三种机制：被动转运（passive transport）、载体媒介转运（carrier－mediated transport）和膜动转运（Membrane mobile transport）。药物在体内的吸收大多数是在小肠中进行的，从不同剂量组对五味子总木脂素吸收影响的实验结果看，在考察的浓度范围以内五味子4种有效成分并没有体现出明显的浓度依赖性，转运过程不符合Ficks扩散定律，说明五味子在考察的浓度范围内可能是属于载体媒介转运。载体媒介转运的特点是：①需要消耗机体能量，能量来源主要由机体细胞代谢产生的ATP提供；②需要载体的参与，载体往往是细胞膜上的膜蛋白或者是标志酶，与药物本身有较高的选择性；③主动转运的转运速率和转运量与载体的量及其活性有关，当药物浓度较低的时候，载体的量和活性相对较高，药物转运速率快。当药物浓度逐渐升高时，载体趋于饱和，转运速率减慢，甚至转运饱和，加上结构相似的化合物之间相互竞争载体结合位点而影响转运。五味子总木脂素4种有效成分高中低三个浓度可能处在载体浓度饱和阶段，加上4种组分基本构架相似，产生竞争结合的现象，因而当浓度加倍增加，吸收转运速率并没有明显的提高。

多药耐药（MDR）是肿瘤细胞免受化疗药物攻击的最重要的防御机制。MDR是由一种药物诱发的、对多种结构和作用机制相似的抗癌药物产生交叉耐药的一种现象，是导致化疗失败的主要原因。能否逆转肿瘤细胞耐药，是提高化疗疗效的关键环节。研究证实，五味子乙素对P－糖蛋白介导的肿瘤细胞 MDR有明确的逆转效果［4］。李玲等［5］研究证实五味子乙素具有逆转多药耐药相关蛋白（MRP）介导的白血病多药耐药细胞株 HL－60／ADR，HL－60／MRP耐药的作用。有文献报道［6－9］，五味子粗提物及其有效成分五味予甲素逆转多药耐药的效果很明显。在与抗肿瘤药物长青新碱、紫杉醇、阿霉素合用对抑制小鼠肉瘤S180生长的增强作用实验中发现，五味子粗提物与这3种药物合用后，三药抑瘤作用均有一定程度的增强，抑瘤率分别达到51.66%、38.11%和53.05%。在机理研究中发现：①五味子能增加抗肿瘤药在耐药肿瘤细胞中的蓄积，从而增强其疗效；②能够抑制P－糖蛋白的表达，提示至少部分通过直接或间接地干扰P－糖蛋白介导的药物而发挥其作用；③能显著增加阿霉素诱导肝癌BEL 7402细胞发生凋亡的易感性：④钙拮抗剂VER能部分拮抗二氢吡啶类钙激动剂BAYK8644介导的细胞内钙增加，提示五味子甲素本身无钙拮抗活性。近年来，天然药物的抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂和抗菌消炎等药理作用成为研究的热点，而五味子木脂素的这一发现无疑让五味子在肿瘤药物的研发领域中占据了重要的位置，为天然药物抗肿瘤提供了新的思路和新的方向。

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