浒苔多糖的微波辅助提取工艺及抗氧化活性研究

徐银峰，王 斌，苏传玲，曲有乐，杨立业

(浙江海洋学院食品与药学学院，浙江舟山 316004)

浒苔为绿藻门石莼目石莼科植物，主要有条浒苔Enteromorpha clathrata、肠浒苔Enteromorpha intestinalis、扁浒苔Enteromorpha compressa、浒苔Entermorpha prolifera、小管浒苔Enteromorpha tubulosa等5种，生活在潮间带，在我国野生藻类中资源丰富，在东南沿海均有分布。浒苔自古以来即为食用和药用藻类，在《本草纲目》中记载浒苔可“烧末吹鼻止衄血；汤浸捣敷手背肿痛”，《随恩居饮食谱》也记载：浒苔“清胆，消瘰疬瘿瘤，泻胀，化痰，治水土不服”。

浒苔营养丰富，是高膳食纤维、低脂肪且富含矿物质和维生素的天然理想营养食品原料[1-2]。目前，浒苔活性物质成分的研究主要集中在浒苔多糖方面，研究结果表明浒苔多糖结构复杂[3-4]，具有显著的药理活性，如降血脂[5]、抗氧化[6]、提高免疫力[7-8]和抑制皮肤癌[9]等生理功能。但是浒苔多糖提取技术的相关报道却较少。微波辅助提取技术(microwave-assisted extraction technique)是近年来新发展起来的一种方法，与传统的提取方法如回流提取、有机溶剂萃取等方法相比，微波萃取技术具有操作简便、节省溶剂、快速高效、节能、省时等优点，已被广泛应用于各种天然活性成分的提取[10-12]。因此，本试验借鉴多糖的提取经验[13-14]，利用正交试验设计对微波辅助提取法浒苔多糖的提取工艺进行优化，旨在为浒苔多糖的深度开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

浒苔购于舟山市南珍菜场，由浙江海洋学院赵盛龙教授鉴定，标本保存于浙江海洋学院食品与药学学院生药学实验室。新鲜浒苔鉴定后清洗除杂，烘干至恒重，粉碎后过20目筛，备用。

葡萄糖、苯酚、硫酸、乙醇等购于国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯，试验用水为去离子水。

1.2 主要设备与仪器

XH-100A型微波催化合成萃取仪(北京祥鸽科技发展有限公司)；722型可见光分光光度计(上海精密科技有限公司)；SK5200H超声波清洗器(上海科技超声仪器有限公司生产)；HWS12型电热恒温水浴锅(上海一恒科技仪器有限公司)；高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 浒苔多糖提取工艺流程

浒苔烘干粉碎→微波辅助浸提→离心取上清液→Sevag法除蛋白→离心取下层澄清液→浓缩→加乙醇沉淀过夜→离心取沉淀→乙醇洗涤→定容显色→测吸光度→粗多糖得率。

1.3.2 多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法[15]，以葡萄糖溶液为标准，根据吸光值与葡萄糖浓度建立回归方程为：A=10.697 C+0.013 4(A：吸光值；C：葡萄糖溶液浓度，10 μg/mL＜C＜100 μg/mL；R2=0.999 1)。多糖提取率/%=(CV/m)× 100

式中：C为浒苔多糖质量浓度(mg/mL)；V为浒苔多糖提取液的体积(mL)；m为浒苔粉末质量/mg。

1.3.3 影响浒苔多糖提取率的单因素试验

1.3.3.1 微波功率对浒苔多糖提取率的影响

采用液料比40:1(g/mL，提取液为pH 5.0的去离子水)，提取温度60℃，提取时间15 min，微波功率分别为500、600、700、800和900 W。以浒苔多糖提取率为评价指标，考察不同提取温度对浒苔多糖提取率的影响。

1.3.3.2 液料比对浒苔多糖提取率的影响

按照液料比20:1、30:1、40:1、50:1和60:1(g/mL)加入浒苔粉末和蒸馏水，控制提取温度60℃、提取时间15 min、微波功率700 W。以浒苔多糖提取率为评价指标，考察不同提取温度对浒苔多糖提取率的影响。

1.3.3.3 提取时间对浒苔多糖提取率的影响

采用液料比 40:1(g/mL)，提取温度 60 ℃，提取时间分别为 5、10、15、20、25 和 30 min，微波功率 700 W，以浒苔多糖提取率为评价指标，考察不同提取时间对浒苔多糖提取率的影响。

1.3.3.4 提取温度对浒苔多糖提取率的影响

采用液料比 40:1(g/mL)，提取温度分别为 40、50、60、70、80 ℃，提取时间 15 min ，微波功率 700 W，以浒苔多糖提取率为评价指标，考察不同提取温度对浒苔多糖提取率的影响。

1.3.4 浒苔多糖提取工艺的优化

单因素试验结果表明，微波功率、液料比、提取温度和提取时间是影响浒苔多糖提取率的主要因素，故以此四因素设计L9(34)正交试验，以浒苔多糖提取率为评价指标，确定提取浒苔多糖的最佳提取工艺。试验设计的因素水平见表1。

表1 浒苔多糖提取工艺的正交试验因素与水平Tab.1 Factors and levels in L9(34)orthogonal array design for optimal polysaccharide extraction process

1.4 不同提取方法对浒苔多糖提取率影响

浒苔多糖热提取方法参照张智芳等[16]的方法略加改动。提取条件为：浸提液pH 5.0，温度70℃，液料比80:1，提取时间为4 h。

浒苔多糖超声提取方法参照于淑池等[17]的方法略加改动。提取条件为：浸提温度75℃、超声功率700 W、液料比80:1，提取时间为1 h。

1.5 浒苔多糖抗氧化活性测定

抗氧化活性测定按照徐银峰[18]描述的方法进行。分别测定浒苔多糖对DPPH自由基和羟自由基的清除率，以及浒苔多糖的还原力。阳性对照品为2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)和没食子酸(GA)。

图1 微波功率对浒苔多糖提取率的影响Fig.1 Effect of microwave power on the yield of polysaccharide

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 微波功率对浒苔多糖提取率的影响

由图1可知，多糖提取率随微波功率的增大先升高再降低，微波功率为700 W时，多糖提取量出现峰值。这可能是因为当微波功率小于700 W时，随着微波功率的增加，浸提物所吸收的微波辐射能越多，物系的温度升高得越快，液料扩散的速度加快，温度越高，对物料细胞的破坏作用越大，有利于物料有效成分的浸出，提高多糖的提取量；当微波功率大于700 W时，随着微波功率的增大，多糖提取率减小，可能是微波功率的增大，造成浒苔多糖的化学性质的变化，降解为单糖或其他物质，而使多糖提取率下降。

2.1.2 提取温度对浒苔多糖提取率的影响

图2 提取温度对浒苔多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide

由图2可知，在提取温度小于70℃时，浒苔多糖提取率随温度的升高而升高；当温度大于70℃以后，浒苔多糖提取率随温度的升高而降低，这可能是由于高温条件下部分多糖水解为单糖或低聚糖，同时温度过高也将导致杂质的浸出增加，多糖得率反而下降，同时会给多糖的精制带来不便。因此，提取温度选择在70℃左右较为适宜。

2.1.3 液料比对浒苔多糖提取率的影响

由图3知，多糖提取率随溶剂量的增加而增加，最后趋于平缓。其原因是浒苔多糖在浒苔中的含量是一定的，其中的水溶性多糖在溶剂中的溶解度有限，当溶液趋于饱和时，多糖溶解量减小。当溶解达到饱和状态后，提取率的增加趋势减缓。由图3可以看出，在一定范围内，液料比越大，浒苔多糖的提取率越高，这说明，随着提取液量的增加，多糖的溶出量越多，但液料比大于40:1后，多糖提取率增加量不明显。从节约溶剂和减少溶剂回收难度角度考虑，选用液料比以40:1为宜。

2.1.4 微波提取时间对浒苔多糖提取量的影响

由图4可知，随着提取时间的延长，浒苔多糖提取率也逐渐增加，但增幅趋势逐渐平缓。这表明浒苔多糖的微波辅助提取过程与时间密切相关，时间过短，多糖溶解不充分，但时间过长又容易引起多糖结构的变化进而使提取率降低。因此，提取时间选择在20 min左右较为适宜。

2.2 浒苔多糖多糖提取工艺的优化

单因素试验表明微波功率、液料比、提取温度和提取时间是影响浒苔多糖提取率的主要因素，其最适条件分别为700 W、40:1、70℃和20 min。但是，在实际应用中，各因素之间会相互交叉影响。因此，为了全面考察影响因素，获得最佳的制备工艺，本试验在单因素试验及数据分析基础上，以微波功率、液料比、提取温度和提取时间为考察因素，并以浒苔多糖提取率为评价指标，做L9(34)正交试验，结果见表2。

图3 液固比(提取液体积/样品质量)对浒苔多糖提取量的影响Fig.3 Effect of the ratio(liquid/solid)on the yield of polysaccharide

图4 提取时间对浒苔多糖提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of polysaccharide

表2 微波辅助提取浒苔多糖的L9(34)正交试验设计及结果(n=3)Tab.2 Orthogonal experiment results of microwave-assisted extraction of polysaccharide from Enteromorpha prolifera(n=3)

由表2极差R值可以看出，各因素对浒苔多糖提取率的影响程度为B>D>A>C，即提取温度是优化条件中影响最大的因素，其次是提取时间、微波功率，最后是液料比。最佳提取工艺条件为A2B2C2D3，即微波功率700 W、提取温度70℃、液料比40:1和提取时间25 min。

2.3 最佳条件下的重现性和回收率试验

2.3.1 重现性试验

取同一批浒苔样品5份，在最佳条件下进行萃取，分别测定各自的多糖提取率，结果表明其相对标准偏差为1.02%。

2.3.2 加入回收率试验

准确称取一定量样品3份，加入不同量的葡萄糖对照品溶液在微波条件下进行萃取，并计算回收率，结果表明回收率在98.7% ～101.5%之间，说明此方法有较好的准确度。

2.4 提取方法对多糖提取率的影响

取同一批样品4份，根据最佳提取条件分别进行微波辅助提取、超声提取和索氏提取，测定3种提取方法的提取率，结果见表3。由表3可知，微波辅助提取法的提取效率高于其他两种方法，同时还可节省大量时间。

表3 提取方法对浒苔多糖提取率的影响(n=3)Tab.3 Comparison of MAE with other extraction methods on polysaccharide yeild from E.prolifera(n=3)

2.5 浒苔多糖抗氧化活性

抗氧化剂可捕获并中和自由基，祛除自由基对机体损害，广泛用于食品工业，需求量逐年增加。而合成抗氧化剂如植物酸(BHA)、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)和特丁基对苯二酚(TBHQ)等的毒性问题，以及人们越来越追求绿色环保消费，开发安全、高效的天然抗氧化剂成为食品工业的一项重大课题。表4中浒苔多糖的抗氧化试验表明其对DPPH·和·OH具有一定的清除能力，同时具有一定的还原力。与阳性对照品BHT和GA相比，浒苔多糖对DPPH·的清除率略高于BHT，其他均低于阳性对照品。

表4 浒苔多糖的抗氧化活性结果(n=3)Tab.4 Antioxidant activities of polysaccharide from E.prolifera(n=3)

3 结论

本研究以浒苔为原料，采用微波辅助提取方法制备多糖，微波辅助提取法的提取效率高于传统热水浸提和超声提取，同时还可节省大量时间。经试验得出微波辅助提取浒苔多糖的最佳工艺条件为微波功率700 W、提取温度70℃、液料比40:1和提取时间25 min。在此条件下浒苔多糖的提取率为10.79%。抗氧化试验表明浒苔多糖对DPPH·和·OH具有一定的清除能力，同时具有一定的还原力。与阳性对照品BHT和GA相比，浒苔多糖对DPPH·的清除率略高于BHT。可以作为抗氧化保健药物，具有进一步的开发利用价值。

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