金属栅栏式腭器官培养模型的建立

卢胜军 何苇 石冰 蒙田 李承浩 封兴华

（1.第四军医大学口腔医院 颌面外科，西安 710032；2.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学，成都 610041）

腭器官体外培养是研究腭裂发病机制的一条重要途径，相比单一的腭胚突上皮细胞或腭间充质细胞的培养，它避免了单一细胞培养的缺陷，可从立体结构上研究腭的发生、发展以及调控机制，而且其排除了体内实验的复杂环境以及诸多干扰因素，成为目前研究腭裂发病机制的重要手段。

与细胞培养相比，腭器官培养需要消耗大量氧气，因而腭器官不能完全浸没在液体里面。本实验采用妊娠14 d的孕鼠，获取胚胎，解剖腭器官，采用金属隔栅式培养法，观察腭器官在体外的发育过程，以期为研究腭裂发病机制提供了一个良好模型。

1 材料和方法

1.1 实验动物

20只成年C57BL/6J小鼠购自四川大学华西实验动物中心，SPF饲养，室温控制在20～25℃，充足食物，自由饮水。按雌雄比例2∶1交配，次日发现有阴道栓者定为妊娠0 d。

1.2 实验试剂

DMEM/F12培养基和胎牛血清FBS（Hyclone公司，美国），35mm培养皿（Falcon公司，法国）。

1.3 金属支架的制备

用不锈钢网自备支架，支架高约1.5 cm，上覆盖一微孔滤膜，孔径0.8μm，置于金属网上。最后将此装置放入培养皿内，加入培养基，刚好浸没过滤膜。

1.4 胚胎的获取以及腭器官的解剖分离

于妊娠14 d，即小鼠双侧腭板相互接触期，无菌条件下处死孕鼠，将胚胎获取后，置于PBS液里面，充分冲洗，去除血渍。在体视显微镜下沿一侧口角入路，去除舌体以及下颌后，获取腭器官，置于微孔滤膜上，腭面朝上，鼻面朝下，双侧腭突紧密接触，这样使得腭突在得到充足的氧气供给的同时，也可以获得足够的营养液的支持。将放有腭器官的金属栅栏，置于35mm的培养皿里面，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基（含链霉素100U·mL-1，青霉素100U·mL-1）。最后将整个装置放置于37℃，5%CO2孵箱里面进行培养。每隔12 h换液1次,分别培养24 h或是48 h。

1.5 苏木精-伊红染色以及光镜观察

分别在培养过程中24和48 h取出样本，用4%的中性多聚甲醛固定，常规脱水，包埋，5μm切片，苏木精-伊红染色后光镜下观察。

2 结果

腭器官培养24 h以及48 h后，培养基液体澄清，器官湿润，有光泽，外观呈现粉红色。苏木精-伊红染色后发现：培养24h后两侧中脊上皮连续完整，并未消失，上皮细胞着色较深。间充质细胞未见细胞坏死，轮廓分明，相比成体细胞，间充质细胞核较多，细胞分裂旺盛，可见分裂的细胞核（图1）。培养48 h后，中脊上皮消失，双侧腭板完全融合（图2）。

3 讨论

双侧腭突的融合包含了2个阶段：第一是腭突从垂直向上升至水平相，第二是水平相的双侧腭突相互接触并最终融合形成继发腭。腭胚突在体外融合的能力因胚胎的年龄及种属来源而异[1-2]。腭器官体外培养模型的建立一方面排除了体内实验的复杂性，便于单一观察某个因子对于腭发育的影响[3]。而目前为止，国内尚未见到金属栅栏式腭器官培养模型的建立。

腭器官体外培养模型能够模拟体内腭器官的整个发生发展过程[4-5]。与细胞培养以及成体器官的培养相比，胚胎腭器官培养需要特殊的培养条件。如果器官完全浸没于液体里面，器官将会因缺氧而坏死；如果完全放置在空气里，其会因为缺乏足够的营养液而无法存活。因此，如何将腭器官放置在一个液—气象的交界面是腭器官培养成功与否的关键。诸多学者为此尝试了许多方法，比如腭器官的旋转培养法及琼脂小岛培养法等，但是上述方法所需过程复杂，并且腭器官的存活率不高。另外胚胎器官来源的细胞生长活跃，迁移能力强，组织尚未完全分化，容易受外界的诱导而向其他方向分化生长，导致培养的失败。因此，为了维持器官的基本形态及结构，需要添加某种抑制物来防止细胞的迁移以及组织的分化，因此，本实验将腭器官放在附有微孔滤膜的金属丝网上，不仅可以抑制细胞迁移，同时可防止腭器官的下沉，这样腭器官在获得充足氧气的同时，也得到了足够的营养液。该方法简单可行，为研究腭裂的发病机制建立了一种很好的模型。

本实验结果显示：经过24 h培养的腭突，中脊上皮连续性完好，间充质细胞增生活跃，细胞轮廓清楚，活力好。经过48h培养后，中脊上皮消失，双侧腭突间充质细胞完全融合。目前，腭器官培养方法在不断的改进，其应用也在不断的深入，相信，其必将为腭裂发病机制的研究起到积极的作用。

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