培养液添加物与去核方法对猪体细胞核移植效率的影响

张 歆 ,张林波,田见晖*

(1.吉林农业大学 生命科学学院生物制药创新实验室，吉林 长春 130118；2.中国农业大学 动物科学技术学院/农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193)

体细胞核移植(SCNT)，又称体细胞克隆。作为动物细胞工程技术的常用手段，即把体细胞移入去核卵母细胞中，使其重组并能发育成新的胚胎，最终发育成个体。其过程主要包括：卵母细胞体外成熟即发育至第2次减数分裂中期(MⅡ期)，脱去颗粒细胞后将供体细胞注入去核的卵母细胞内，经过电融合、化学激活和后期培养发育到相应的时期后移植到受体内直至妊娠。进行猪的克隆研究最重要的意义在于进行异种器官移植，生产无免疫排斥反应的转基因猪，将其器官应用于人类临床医学的相关研究，因而具有巨大的社会和经济价值。生产转基因猪首先在体外培养的体细胞中进行基因导入，筛选稳定整合外源基因的阳性转基因细胞，然后将转基因体细胞核移植到去掉细胞核的卵细胞中生产重构胚胎，经移植到母体中发育产生仔畜[1]。尽管有很多体细胞核移植的克隆猪出生，也做了许多技术上的改进，但是总的效率还是很低。影响转基因克隆效率的因素很多，包括卵母细胞的成熟液成分及培养时间，去核和融合方法，供体细胞的类型、周期，及供体核进入卵母细胞后的重编程过程等。近些年来许多研究者都致力于对提高克隆效率的研究。本文将从三方面对克隆效率的影响及近年来在这几方面的成果进行综述，即在卵母细胞的成熟、去核和后期发育过程中添加化学成分对体细胞核移植效率的影响。

1 在成熟液中添加化学成分对SCNT的作用

卵母细胞的成熟是胚胎体外生产体系的一个非常关键的步骤，它影响着卵母细胞的发育能力和质量，进而直接影响胚胎的发育，甚至是后代幼仔的健康[2]。和体内的成熟相比，体外发育的能力还是很低的，因此，提高SCNT的效率必须对成熟培养液进行优化。

1.1 成熟液体系在各国家的应用情况

关于卵母细胞的成熟很多人用的是两步成熟过程，第1步是卵丘卵母细胞在含有激素的成熟液中培养20～22 h，比如添加eCG和hCG来促进核成熟；第2步使卵丘卵母细胞在不含有激素的成熟液中培养18～24 h，移除激素是为了减慢核成熟提高细胞质的成熟。比较了卵母细胞的成熟体系之后，发现有8个实验室都在用北卡罗来纳州大学的培养液(NCSU-23)，添加10%的猪卵泡液作为基本的成熟培养液，有4个实验室用NCSU37+10%猪卵泡液，5个利用TCM199+10%PFF，有1个用TCM199添加0.1%PVA。这些基础培养液还另外添加了许多不同成分，如半胱氨酸、EGF、dbcAMP、胰岛素和氨基酸等[3]。

1.2 成熟液中添加leptin等物质对SCNT的影响

体外成熟的卵母细胞受诸多因素的影响，包括成熟时间、温度、相关的细胞因子等[4]。在这些因素中，补充细胞因子在卵母细胞核质成熟中起着重要作用[5]。研究者发现，在小鼠的卵母细胞卵泡发育的各个阶段和卵母细胞成熟过程中都发现有leptin的高表达，推测可能与卵母细胞的成熟有关。向猪卵母细胞的成熟液中添加leptin，最终发现可以提高孤雌发育和SCNT胚胎的发育能力，而且具有剂量依赖性。研究还发现，leptin是通过MAPK通路来促进核与质的成熟[6]。实验结果表明，核移植的显微操作过程中，leptin处理组和对照组相比，在融合和激活之后卵母细胞的死亡率都会降低[7]。在最近一项实验中提到，铵可以影响核和质的成熟，尤其是谷氨酰胺，能够产生铵离子，对细胞产生毒害作用。若将IVM液中的谷氨酰胺换成丙酰胺基谷酰胺或者甘氨酰基谷酰胺就可以减少铵的累积，保护卵母细胞不受铵的破坏，顺利完成减数分裂和后期的发育[8]。据Guo-Shi Liu报道，褪黑素在卵泡液中的浓度大约是10-11mol/L，这就说明褪黑素在卵母细胞成熟过程中起着重要作用。作者在成熟培养液中添加不同浓度褪黑素，结果囊胚率和囊胚细胞数均高于对照组[9]。而在另外一项报道中也有类似的结果，只是细胞数一项没有提高[10]。诸多实验结果表明，褪黑素是一种直接作用的抗氧化剂，具有强烈清除活性氧的作用[11]，有助于提高SCNT效率。

表1 各国家之间生产非转基因猪其成熟培养液使用情况比较

2 去核方法对SCNT效率的影响

2.1 物理去核

利用胞质体作为核移植的受体首先就要清除卵母细胞内的遗传物质，这样就必须先确定卵母细胞核的位置。通常所用的方法是盲吸法，就是以第1极体作为标记来确定MⅡ期卵母细胞纺锤体的位置，吸掉整个极体和极体下面很少的一部分胞质。但是许多情况下赤道板和第1极体不在相邻的位置上[12]，这种现象在牛和兔上也有报道。实验指出只有50%的纺锤体存在于第1极体附近，甚至更少[13]。为了提高去核率，第1极体下面有时有1/3的胞质被吸走，这样大量地去除胞质可能会导致转基因核重排能力的下降甚至发育不完全。而且，若在卵母细胞成熟之前即脱掉颗粒细胞，这样会破坏第1极体和MⅡ期纺锤体的相互作用，导致在去核之后仍有遗传物质的残留[14]。还有许多物理去核方法，诸如在卵母细胞成熟的不同时期进行去核等[15-17]，对后期发育都存在不同程度的影响。

2.2 化学去核

化学去核就是使用化学药物进行处理来辅助移除卵母细胞的染色体。利用细胞骨架修饰因子，如细胞松弛素B、秋水仙胺和nocodazole可以改变重构胚胎中DNA内含物的结构和功能。秋水仙素是一种微管解聚剂，可以有效地诱导卵母细胞的去核过程。而且，在激活之后用秋水仙素处理可以使猪的转基因胚胎完整地发育，诱导单个的前核形成并提高DNA的倍性[18]。和秋水仙素相似，nocodazole可以成功地进行辅助去核过程，它能够稳定中期赤道板，产生1个小的突起，使染色质更为明显，容易去除[19]。nocodazole的去核作用使人们开始尝试利用化学辅助去核方法生产转基因克隆猪。在研究的早期有人应用etoposide，或者etoposide和放线菌酮的复合体，或者乙醇和秋水仙胺。但是此种化学处理方法和常规的去核方法相比，卵裂率和后期发育率均很低[20]。

2.3 其他的去核方法

用3%的蔗糖处理小鼠的卵母细胞会使其在光学显微镜下出现更多的半透明部分，更容易观察减数分裂的纺锤体形态[21]。还有人报道说，POL-scope系统可以使纺锤体的定位观察更加直观，但是这种仪器非常昂贵，在不同的品种之间还需要多重复合[22]。如果把牛的卵母细胞离心然后结合CB的处理，去核后也有发育能力，但是这种方法必须移除透明带，这可能会阻碍到后期的进一步发育[23]。

3 在胚胎发育液中添加物质对SCNT效率的影响

3.1 CSF2

有一系列的论据可以证明，CSF2在早期胚胎发育过程中作为一个生理学重要的调节器而发挥作用。在腔上皮组织和输卵管以及子宫内膜组织中有表达[24,25]。CSF2在胚胎发育过程中作为一个重要的调节因子可以提高克隆胚胎的耐受性，在移植之后可以提高囊胚率和妊娠率。其原因一方面可能是CSF2可以促进有丝分裂，增加胚胎的细胞数，充分地促进囊胚腔的形成。另一方面，CSF2通过阻断细胞凋亡来增加细胞数。通过观察，CSF2处理的卵母细胞有相当数量的与外滋养层有关的内细胞团，表明CSF2影响着囊胚的分化[26]。此结论在人和小鼠上都有过验证。

3.2 TSA(组蛋白脱乙酰基酶抑制剂)

目前认为：供体核的不完全重编程是导致克隆效率低的主要原因。关于供体核的重编程，其研究主要集中在DNA甲基化和组蛋白乙酰化。组蛋白的乙酰化发生在核心组蛋白的赖氨酸残基上[27]。核心组蛋白在MⅠ期高度乙酰化，然后立刻去乙酰化，在MⅡ期大多数的核心组蛋白赖氨酸位点都去乙酰化，除了H4K8位点[28]。体细胞基因组中核心组蛋白的乙酰化有两种，第1种发生在组蛋白H3K4的3个赖氨酸位点上，在体细胞核移植之后立刻发生去乙酰化，3 h后完全去乙酰化。卵母细胞激活之后在这些位点上发生再次乙酰化。在SCNT过程中这种组蛋白赖氨酸位点的去乙酰化和重新乙酰化过程对克隆胚胎的基因表达和全能性的建立是非常关键的，也直接影响着克隆效率。

最近的一项研究表明，提高供体细胞或者克隆胚胎中组蛋白的乙酰化水平可以促进发育从而提高效率[29]。用一种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂处理牛的胎儿成纤维细胞可以提高克隆胚胎的发育[30]。另一种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂TSA，可以提高克隆效率，在牛和小鼠上都已经有过验证[31,32]。在2009年，也有研究表示，TSA处理可以提高克隆胚胎基因组的乙酰化水平，在很多物种中都提高了后期发育能力[33]。而且TSA处理的兔SCNT胚胎的组蛋白乙酰化程度比未处理组要高。这种现象在TSA处理的小鼠SCNT胚胎中也得到了验证[32]。在猪的手工克隆中也有TSA的应用，而且可以很显著地提高发育能力，并顺利完成整个发育过程[34]。但是在同年，据Meng报道，用TSA处理兔子的SCNT胚胎，限制了其后期发育的能力，没有提高囊胚率，处理和未处理组均有后代产生，但是TSA处理组没有发育到成年[29]。可能的原因就是，在不同的物种中体细胞核移植操作的差异导致了不同的结果。在现在的研究中，人们试图筛选TSA处理合适的时间及浓度，这就需要正确的SCNT操作方法，TSA适当的处理以及特异的物种之间成功的结合才能够最终达到提高转基因效率的目的。

3.3 褪黑素

机体在有氧代谢过程中产生的活性氧族(ROS)对大多数细胞都具有毒性作用。当ROS产生增多或者机体清除能力下降时机体就会出现氧化应激。为了阻止机体产生氧化应激，在培养介质中添加抗氧化剂或者自由基清除剂，结果发现可以有效地提高胚胎的发育能力。褪黑素，又名N-乙酰-5-氧基色胺，是有效的自由基清除剂和抗氧化剂[35]。和其他已知的自由基清除剂相比，褪黑素具有多功能性而且比较普遍。它作为一种既疏水又亲水的复合溶液，可以溶解在水中和类脂中，说明褪黑素和它的代谢产物可以直接清除羟基自由基、烃氧基、过氧化氢根、亚硝酸盐阴离子、氧化亚氮和单独的氧，而且，褪黑素还能够修复被氧化的分子，抑制脂质过氧化反应等[36]。有报道说，褪黑素还可以提高小鼠的囊胚发育率[37]。通过毒性试验验证，在小鼠和兔子的胚胎发育上无论在体内还是体外组均无毒害作用。据Yuichi ro Kitagawa报道，在低氧条件下，猪卵母细胞体外发育过程中可以减少过氧化氢含量，从而减少了DNA断裂的发生，提高了胚胎的发育能力[38]。Krzysztof Papis等人还做了进一步的研究，发现在20%高氧条件下添加褪黑素可以促进发育，在7%低氧条件下反而会抑制发育，这是否说明褪黑素在低氧条件下产生了副作用，或者影响了乙酰化过程还需要进一步验证[39]。

3.4 nocodazole

nocodazole是一种细胞骨架修饰因子。若将细胞支架的修饰因子注入到SCNT的卵母细胞中，可以影响核的重塑，抑制由于阻断微管的解聚而导致的同源染色体的丢失，提高DNA的倍性和SCNT的发育。核的重排和保持核的倍性是转基因胚胎发育的必要条件。在目前国内的研究中，已经验证了nocodazole的作用，它是一种细胞骨架修饰因子，可改变供体核的形态，引入已经去核的卵母细胞中从而影响猪转基因胚胎的后期发育。结果显示，卵母细胞激活之后用nocodazole处理可以提高单核的形成率，通过排出极体来抑制DNA的丢失，从而保证了核的倍性。nocodazole处理可以使转基因胚胎完成完整的发育过程，但是幼仔的形成率一项和对照组相比没有明显的差异[40]。在先前许多研究中都发现，无论是孤雌胚胎还是转基因胚胎中，细胞骨架修饰因子如秋水仙胺和细胞松弛素B都可以保留核的遗传信息，这很可能影响了微管的组装[41]。

4 结语

在卵母细胞成熟、去核以及后期发育过程中添加化学物质，均不同程度地提高了核移植的效率，但传统的添加实验基于经验式的摸索，具有盲目性和不可重复性，而且效率低下。近些年研究表明，体细胞核重编程的不完全是克隆胚胎发育效率低下的重要原因，虽然已有个别实验室通过添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂等药物来提高克隆胚胎的发育能力，但进展缓慢。因此，采用表观遗传学研究的相关手段，解析克隆胚胎发育过程中体细胞核的重编程过程将是未来克隆技术研究的一个重要方面。此类研究对于改进体细胞核移植技术，保证克隆胚胎的安全性具有重大的意义。

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