电针对拟老年性痴呆大鼠学习记忆功能和海马CA1区突触可塑性的影响

王 威 唐 伟 孙忠人

(大连大学附属中山医院康复医学科，辽宁 大连 116001)

迄今为止，治疗老年性痴呆(AD)尚无特效药物。长期以来针刺治疗AD的实验研究多局限于单因素的动物模型，不能充分体现AD与衰老及多种环境因素相关的病理机制。本研究通过建立一个集衰老、铝中毒以及胆碱能系统损害等多因素的AD动物模型，采用行为学、免疫组化和图像分析技术，研究针刺对AD大鼠学习记忆、海马CA1区超微结构和突触素表达的影响，探讨针刺改善AD大鼠学习记忆功能的中枢机制，为针刺治疗AD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与设备 健康雄性Wistar大鼠50只，由大连医科大学动物实验中心提供(许可证号为辽实动质字〔2000〕028号)。自由进食，每日照明12 h，室温(23±2)℃。JEM-1220型透射电子显微镜;LKB-V超薄切片机;跳台仪(大连大学附属新华医院提供);图像分析系统(Image Pro Plus 6.0，美国)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 按照体重将50只大鼠随机分成4组:空白对照组(10只)、空白电针组(10只)、模型组(15只)和模型电针组(15只)。全部实验动物用相同的饲料喂养，整个喂养过程中所使用的器皿均为非铝制品。①空白对照组:予常规饮水和饲料，并胃饲及腹腔注射与模型组等容量的生理盐水;②空白电针组:在给予生理盐水同时进行电针治疗;③模型组:东莨菪碱(SCOP)+AlCl3+D-半乳糖(D-gal);④模型电针组:在造模同时进行电针治疗。

1.2.2 穴位选择 ①百会:顶骨正中;②大椎:第七颈椎棘突与第一胸椎间，背部正中;③肾俞:第二腰椎下两旁;④足三里(后三里):膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处。

1.2.3 针刺方法 用0.25 mm×15 mm毫针针刺大鼠“百会”穴，向前斜刺约3 mm，“大椎”穴，直刺约4 mm，双侧“肾俞”穴，直刺进针5 mm，双侧“足三里”穴，直刺进针5 mm。连接KWD-808Ⅱ型全能脉冲电疗仪，疏波，频率为2 Hz，电压为2 V，强度以肢体轻微抖动为度;1次/d，时间20 min。10 d为1个疗程，间歇1 d，治疗3个疗程后进行行为学测试。

1.2.4 大鼠行为学检测 跳台实验〔1〕:电针治疗结束后进行跳台实验;实验装置体积为15 cm×30 cm×30 cm的被动条件反射箱，箱底铺以铜栅，铜丝直径为2 mm，间距为5 mm;电流强度由一个可调变压器控制，通以36 V电流，箱内右后侧放置一个高和直径均为4.5 cm的橡皮垫作为大鼠逃避电击的安全区。将大鼠放入箱中自由活动3 min，熟悉环境，然后箱底通以电流，其正常反应是跳上平台以躲避伤害性刺激;记录大鼠首次跳到铜栅上的时间(即潜伏期)和5 min内大鼠跳到铜栅上的次数(错误次数)，以此作为学习成绩。24 h后重复试验，记录其第一次跳下橡皮垫的潜伏期和5 min内的错误次数，从而反映大鼠的记忆保持能力。

1.2.5 海马区CA1区苏木素-伊红(HE)染色和突触素表达检测 用10%水合氯醛将大鼠麻醉，于冰台上迅速取出脑组织，分离海马，切片并置于10%中性甲醛溶液中固定，4℃过夜，常规梯度脱水，透明，石蜡包埋，切片(4μm)。用HE染色光镜下观察海马CA1区组织形态学变化。用链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶(SP)免疫组化方法染色，石蜡切片置于二甲苯脱蜡水化，加入3%H2O2阻断内源性过氧化物酶的活性。滴加一抗(兔抗大鼠突触素浓度1∶150)，4℃孵育不少于18 h，加入生物素二抗，在37℃孵育20 min，DAB显色，HE轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片。在显微镜(Olympus，BX60，Japan)下观察突触素蛋白的表达，用图像分析系统(Image Pro Plus 6.0，美国)测量其平均灰度值。

1.2.6 电镜观察海马CA1区超微结构 各组分别取5只大鼠，麻醉，暴露心脏，灌注4%多聚甲醛与1%戊二醛，取脑，分离并留取海马CA1区，1%锇酸4℃冰箱中固定1～2 h，逐级丙酮脱水，浸透2 h，Epon812包埋液，LKB型超薄切片机超薄切片(500Ä～800Ä)，醋酸铀染，枸橼酸铅染。电镜下观察海马CA1区超微结构。每只大鼠观察1张铜网，每张铜网连续拍摄10张照片，底片放大2.5万倍印相。借助图像分析系统和摄录仪测量突触的面数密度、面积密度和体积密度。面数密度即参照系截面单位面积内颗粒截面数目，单位为个/μm2。面积密度表示膜面积相对于参照系体积的多少，单位为μm2/μm3。体积密度表示结构体积在参照系体积中相对大小的参数。

1.3 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行分析，数据以x±s表示，各组间各参数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 实验动物数量 纳入动物50只，48只大鼠进入结果分析，模型组和模型电针组各有1只动物因胃饲误入气管致死。

2.2 跳台实验(潜伏期、错误次数)结果 与空白对照组比较，模型组大鼠出现明显的学习记忆功能障碍，潜伏期缩短，错误次数增加(P＜0.01)。与模型组比较，电针治疗能够改善大鼠的学习和记忆功能，延长潜伏期和减少错误次数(P＜0.05，P＜0.01)。见表1。

表1 各组跳台实验结果(x±s)

2.3 海马CA1区HE染色结果 空白对照组和空白电针组海马CA1区神经细胞排列整齐紧密，形态完整，胞浆丰富，胞核饱满，核仁清晰。模型组神经细胞缺失较多，残留的神经细胞排列松散不规则，边界模糊，边缘出现空泡，有的胞核消失。模型电针组神经元数目较模型组明显增多，神经元胞浆丰富，核仁清晰。见图1。

2.4 海马CA1区突触素表达结果 空白组、空白电针组海马CA1区突触素表达较多，二者之间无显著性差异(P＞0.05)。模型组海马CA1区突触素表达减少，与空白组相比有显著性差异(P＜0.01)。模型电针组与模型组比较，突触素表达增加(P ＜0.01)。见表2，图2。

图1 海马CA1区HE染色

图2 海马CA1区突触素表达

2.5 海马CA1区突触电镜结果 空白组、空白电针组神经毡内可见大量突触，突触前后成分境界清楚，轮廓完整，突触前终末内突触小泡多，分布密集均匀，多为圆形清亮小泡。模型组神经毡内突触数目减少，突触前膜不清晰，突触间隙模糊，前、后膜不明显，突触小泡明显减少甚或消失，突触前、后膜破坏变薄，典型的突触结构已不存在。模型电针组神经毡内可见较多突触，突触前终末内突触小泡也较多，可见较多圆形清亮小泡，密集分布，突触前、后膜较模型组增厚，与空白组接近。见图3。

图3 海马CA1区突触超微结构

表2 各组大鼠海马CA1区突触素表达和超微结构各参数比较(x ± s，n=5)

3 讨论

中医防治AD主要是从整体的角度去分析这一病证的内在实质，针对某一病证个体做出客观的判断，实施针对性很强的防治措施。本研究所选百会穴为髓海的上俞穴，治疗髓海不足健忘、老年性痴呆的要穴;大椎穴是手足六阳经的交会穴，为“诸阳之会”;百会穴和大椎穴均为督脉之穴，二穴相配可通调诸经，激发经气，增强各脏腑经络之功效，使脑髓得气血荣养，促使阴阳平衡。肾俞为膀胱经穴位，可益肾填髓充脑，《灵枢·经脉》言“膀胱足太阳之脉，起于目内眦，上额交巅。其直者，从巅入络脑”。足三里为强壮保健的要穴，有延缓衰老的作用。如此配穴体现了配穴原则中的局部与远道取穴的结合运用。数穴合用，临床上取得较好疗效。

有研究表明，D-gal致亚急性衰老模型、慢性铝中毒和SCOP中毒都能模拟老年痴呆样改变〔2～4〕，三种因素复合的模型能更贴近AD复杂的病因和病理变化过程，在这种模型上研究针刺作用效果所得出的结论可能更加可靠。从本研究建立的集衰老、铝中毒与东莨菪碱损害的多因素AD大鼠模型行为学观察表明，大鼠跳台测试的触电潜伏期及5 min错误次数与对照组比较均有明显改变。模型组海马区形态学可见神经细胞缺失，神经毡内突触数目减少，突触小泡明显减少甚或消失，典型的突触结构已不存在，与临床上AD的病理变化相似。

突触变化是学习记忆形成的一个重要形态学和功能学基础。突触丧失会中断很多功能通路的联系，引起多方面的功能障碍，尤其是认知和记忆功能障碍。Selkoe〔5〕通过颞、额叶皮质活检研究发现，早期AD患者皮质的突触密度减和神经元的突触数目减少均减少。突触素是一种与突触结构和功能极为相关的膜蛋白，参与突触小泡膜与突触前膜的融合和神经递质的释放，是突触重建的重要标志〔6〕。研究发现突触素免疫活性与AD患者的认知障碍程度相关〔7〕，国内学者洪岸〔8〕用单克隆抗突触素抗体免疫组化染色，结果表明老年损害组大鼠海马、齿状回突触素免疫反应产物灰度较青年组、老年正常组明显降低;老年大鼠平均逃避潜伏期与其海马结构突触素免疫反应产物灰度呈显著负相关，提示老年学习记忆能力与海马结构突触素有密切联系。而本实验模型组潜伏期缩短，错误次数增多，海马CA1区突触素表达减少。突触素是在神经元胞体合成，在囊泡中被运至轴突终末。突触素表达减少的可能原因:①轴突终末丢失;②突触素合成减少。

有研究表明针刺具有拮抗衰老过程中的病理生理变化〔9～11〕。本实验针刺治疗组海马CA1区突触素表达明显多于模型组，提示针刺促进了海马区突触素表达。而电镜下观察到电针组海马区神经毡内可见较多突触，突触前终末内突触小泡也较多，可见较多圆形清亮小泡密集分布，与突触素免疫反应结果相吻合。针刺改善AD大鼠学习记忆能力的机制，可能是针刺刺激增加了大鼠由于造模而损伤坏死的边缘区的记忆突触，即胆碱能突触，使其密度增加，从而使残存的神经元发挥更大的作用，使记忆突触间隙变窄，得以加速突触间的传导功能;同时脑内存在一些神经传导的旁路，针刺刺激可引起神经冲动，经外周神经传导至中枢神经系统，经平时少起作用的旁路刺激大脑皮层，从而引起坏死边缘区突触数目和结构的改变;突触后膜致密物质厚度增加，可能与某些酶及其底物蛋白的磷酸化过程引起其分子构型改变有关，这可能是功能变化的形态学基础。因此，可以推测针刺是通过促进海马内突触重建，提高突触素的表达，从而改善AD大鼠的学习记忆能力，这可能是针刺改善AD大鼠模型智能障碍的机制之一，也为针刺治疗AD提供了思路。

1 徐淑云.药理实验方法学〔M〕.第2版.北京:人民卫生出版社，1994:660.

2 李文彬，韦 丰，范 明，等.D-半乳糖在小鼠上诱导的拟脑老化效应〔J〕.中国药理学与毒理学杂志，1995;9(2):93-5.

3 朱清华，熊希凯，章锡平，等.铝对大鼠学习记忆神经递质脑结构形态的损害〔J〕.同济医科大学学报，1992;21(增):8-10.

4 李 斌，郭德玉，李 林.三种老年痴呆动物模型行为学比较〔J〕.中国实验动物学报，1999;7(1):37-42.

5 Selkoe DJ.Alzheimer's disease is a synaptic failure〔J〕.Science，2002;298(5594):789-91.

6 Terry RD，Masliah E，Saimon DP，et al.Physical basis of cognitive alter-nations in Alzheime's disease:synapse loss is the major correlate of cognitive impairment〔J〕.Ann Neurol，1991;30(5):572-80.

7 Masliah E，Terr R.The ro1e of synaptic proteins in the pathogensis of disorders of the central nervous system〔J〕.Brain Pathol，1993;3(1):77-85.

8 洪 岸.老年大鼠学习记忆减退与海马结构的突触素改变〔J〕.解剖学报，1996;27(2)164-8.

9 Cheng HY，Cheng DQ.Progress in research on acupuncture treatment of senile dementia〔J〕.J Tradit Chin Med，2009;29(3):224-33.

10 朱书秀，孙国杰.电针对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆能力及海马区胶质细胞的影响〔J〕.中国针灸，2009;29(2):133-6.

11 Xue WG，Ge GL，Zhang Z，et al.Effect of electroacupuncture on the behavior and hippocampal ultrastructure in APP 695 V 717 I transgenic mice〔J〕. 针刺研究，2009;34(5):309-14.