Aβ1-42诱导原代海马神经细胞建立阿尔茨海默病细胞模型

张云鹤 张一娜 刘 歆 王 立

(哈尔滨医科大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150086)

阿尔茨海默病(AD)退行性改变可能由神经细胞过度凋亡引起。β淀粉样蛋白(Aβ)是构成SP的核心成分，对神经元具有直接毒性作用，且被认为是神经元凋亡的诱导因素，是AD的病因学事件。由于AD时产生较多的Aβ1-42，且Aβ各亚型中Aβ1-42毒性最强，对AD的发生及发展起着重要作用。因而，以Aβ1-42诱导原代海马神经细胞建立稳定的AD细胞模型最理想，并为从分子及细胞水平研究AD的发病机制及进一步探讨新的治疗途径奠定基础。

1 材料与方法〔1～3〕

1.1 动物 新生24 h Wistar大鼠由哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供。

1.2 试剂 DMEM/F12购自北京Hyclone公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，胰蛋白酶消化液购自Beyotime公司，多聚赖氨酸及阿糖胞苷购自Sigma公司，B-27购自Gibco公司，Aβ1-42购自 Sigma公司，neurobasal购自 Gibco公司，AnnexinVFITC购自BD公司，青链霉素购自Beyotime公司，MTT购自Amresco公司，DMSO购自Amresco公司，NSE(即用型)购自武汉博士德公司，SABC及DAB购自武汉博士德公司，GAP-43购自Abcam公司，山羊抗小鼠IgG(tritc)及山羊抗兔IgG(FITC)购自Santa Cruz中杉公司分装。

1.3 溶液配制 ①种植培养液:体积分数83%DMEM/F12+15%胎牛血清+1%青链霉素+1%谷氨酰胺溶液(200 mmol/L)。②维持培养液:体积分数97%neurobasal+2%B27+1%谷氨酰胺溶液(200 mmol/L)。③Aβ1-42用三蒸水配制成100μmol/L，过滤，分装，－20℃冻存;使用前配制成所需浓度，并在37℃孵育7 d。

1.4 培养皿的预处理 0.01%多聚赖氨酸包被无菌培养瓶，4℃过夜，用0.01 mol/L PBS液洗净置于无菌超净台自然晾干。1.5 原代培养 取出生24 h Wistar大鼠，用75%乙醇消毒，无菌条件下分离出海马组织，置于冰浴PBS液中，小心剔除血管及筋膜，用PBS液冲洗干净，剪成1 m3的组织块(以上步骤均在冰上进行)。加入适量37℃温浴种植培养液，用火焰刨光的长玻璃吸管轻轻吹打成混悬液，以200目无菌不锈钢网筛过滤，1 000 r/min离心5 min，以种植培养液重悬，计数后以2×106/ml密度接种于无菌培养瓶内。24 h后全量换为维持培养液。72 h后加入阿糖胞苷溶液(终浓度为2.5 mg/L)，以抑制成纤维细胞及神经胶质细胞的生长，并半量更换培养液，此后每三天半量更换培养液。

1.6 实验分组 将培养6 d的海马神经细胞转移至96孔板内，接种密度为1×104/孔，24 h后待细胞贴壁，将细胞分为5组，加入Aβ1-42，使其终浓度分别为:A组，0μmol/L(对照组);B组，10 μmol/L;C 组，20 μmol/L;D 组，30 μmol/L;E 组，50μmol/L，并继续培养行以下检测。

1.7 MTT法测细胞活力 每组设3个平行样本，取均值。96孔板分别培养72 h，每孔加入20μl MTT(浓度为5 mg/ml)，调零孔只加培养液。37℃继续培养4 h后，以扣板法扣除液体，每孔再加入150μl DMSO，37℃振荡10 min，待紫色结晶充分溶解后，置酶标仪上，以滤过波长570 nm，测各孔光吸收值(OD)。然后以OD值求细胞存活率。以对照组为参照，细胞存活率(%)=实验组OD/对照组OD×100%。

1.8 Annexin V/PI双染法，流式细胞法检测结果 将培养7 d的海马神经细胞加入Aβ1-42，使其终浓度分别为A组，0μmol/L(对照组);B组，20 μmol/L;C组，30μmol/L;D 组，50μmol/L。继续培养72 h后经消化、重悬进行Annexin V/PI双染，并通过流式细胞仪检测结果。

1.9 统计学分析 所有数据以x±s表示，组间比较用单因素ANONA。统计由SPSS13.0软件处理。

2 结果

2.1 形态学改变 接种后的海马神经细胞单个均匀分布，圆形，小而透亮，培养24 h后细胞完成贴壁且部分已长出突起;至3 d时，细胞间已形成稀疏的网络，突起长度为胞体3～5倍，胞体呈多角形或椭圆形，周围有光晕，胞体体积较大，透光性强，核大;培养至6 d，细胞树突发达，相互连接形成致密的网络，神经元胞体饱满，细胞生长成熟。见图1。造模后的细胞可见较多凋亡细胞，胞体收缩、变形，甚至细胞膜完整性破坏，细胞坏死，细胞突起断裂、消失，细胞间网络消失，细胞外基质杂乱不清。见图2。

图1 生长7 d海马神经细胞(×400)

图2 阿尔茨海默病细胞模型(×400)

2.2 Aβ1-42对细胞活力的影响 Aβ1-42浓度为10μmol/L时神经细胞生存率(98.36±1.388 52)%较对照组(100%)未见明显的下降;当Aβ1-42浓度为20μmol/L时，细胞生存率较对照组出现明显的下降〔(96.8±4.161 73)%，P＜0.05〕;Aβ1-42浓度增加到30μmol/L乃至50μmol/L时，下降更为明显〔(64.02±0.822 8)%，(43.52 ±0.960 21)%，P ＜0.01〕。

2.3 流式细胞术检测结果 由流式结果可见，Aβ1-42浓度为20μmol/L时，神经细胞的凋亡及坏死率仅为7%;当浓度增加到30μmol/L时，细胞生存状态出现明显变化，凋亡及坏死率增加明显，可达40%以上;浓度继续增加至50μmol/L时，细胞凋亡率无显著增加，而继发性坏死却明显增加(由24.4%上升至40.3%)。

3 讨论

AD是多因素、多途径共同作用的复杂病程，Aβ对AD发病具有密切关系，不仅既可以增强和放大各种伤害性刺激，又具有直接的细胞毒性。Aβ是β淀粉样前体蛋白(APP)的正常代谢产物。APP是由695～770个氨基酸组成的跨膜蛋白，在脑内经Aβ源途径加工产生39～43个氨基酸的Aβ片段。其中由42～43个氨基酸组成的蛋白质片段，称Aβ1-42，主要存在于AD患者的脑组织中〔4〕。通过对AD转基因鼠的研究发现Aβ沉积、斑块周围的神经炎改变、突触缺失等典型的病理改变亦成为Aβ对AD发病机制作用的证据。细胞凋亡是引起AD脑组织神经元数目减少的重要原因之一，同时，Aβ也可以通过坏死途径导致神经细胞损伤〔5〕。因此，利用Aβ建立良好而稳定的AD细胞模型有助于从细胞和分子水平进一步研究AD的发病机制。

目前建立AD细胞模型以原代培养神经元、神经嵴源细胞为主，其次为神经胶质细胞、基因工程细胞及杂交组织细胞等。现已有充分的证据表明AD的认知功能障碍与海马神经元大量丢失密切相关，且原代海马神经细胞培养实验成本低，重复性高，故用以建立AD细胞模型代表性及实验性更强。研究表明，长片段的Aβ1-42比Aβ1-40更易形成不溶性聚集体，神经毒性更强〔6〕。因此，以Aβ1-42诱导原代海马神经细胞是体外研究AD的理想细胞模型。

本研究提示随着浓度的增加，神经元的凋亡及继发性死亡增加。凋亡与坏死是细胞死亡的两种方式，正常体外培养细胞生长到一定时间可发生自主性凋亡和继发性死亡，60 h内凋亡率＜9.3%，死亡率＜3.7%〔7〕。流式结果提示细胞毒性作用不明显。浓度增加至30μmol/L时，凋亡率及继发性死亡率明显增高凋亡及坏死率达40%，可见此浓度Aβ1-42已显示出较强的细胞毒性。浓度继续增加至50μmol/L，存活细胞下降至50%以下，提示药物浓度过大，不宜用以造模。Annexin-V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对磷脂酰丝氨酸(PS)有高度的亲和性，细胞凋亡及坏死时PS均可转移到细胞膜外，因此仅靠传统的Annexin-V染色无法区分凋亡和坏死;PI可以进入破损细胞膜内与降解DNA结合，因此，二者联合应用可以区分早期凋亡、晚期凋亡及继发性坏死〔8〕。Aβ1-42浓度为20μmol/L时早期凋亡细胞较少，且晚期凋亡及死亡细胞可能为自发性而非继发性;当浓度增加到30μmol/L时，出现明显的凋亡及坏死;浓度继续增加到50μmol/L时，细胞早期凋亡增加不明显，而晚期凋亡及坏死明显增加。

本实验对以往海马神经细胞原代培养方法进行了改良，未加入胰酶进行消化，仅以刨光长玻璃吸管轻轻吹打，继而以200目无菌不锈钢网筛过滤，离心弃上清后以种植培养液接种。传统方法均以胰蛋白酶消化继而吹打，由于消化时间及温度不易把握，且胰蛋白酶加入至组织悬液后的终浓度对消化效果亦有影响，极易造成消化过度或不充分。且消化后继续吹打易损伤神经细胞，影响接种后细胞生长。应用胰蛋白酶将增加一次离心步骤，此亦可能造成神经细胞的损伤。所以，取消胰蛋白酶消化，大大降低了细胞受损可能，且吹打更为均匀，有助于细胞生长。本实验中经多次尝试，发现2×106/ml接种密度细胞生长状态最佳，易贴壁且适合细胞生长。

综合统计学数据、流式结果及细胞形态学变化，Aβ1-42浓度30μmol/L，作用时间72 d条件下培养的细胞会出现明显的凋亡特征，可作为较理想的AD细胞模型，继而可以为从分子水平及细胞水平研究探索AD的发病机制及开拓新的治疗途径提供了理想的研究载体，具有极大的经济和社会价值。

1 王 英，苗建亭，李柱一.β淀粉样蛋白诱导体外培养海马神经细胞死亡方式的研究〔J〕.中华老年心血管病杂志，2006;8(2):129-32.

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3 杜怡峰，张 晨.新生大鼠海马神经细胞原代培养方法的改良〔J〕.青岛大学医学院学报，2002;38(1):55-6.

4 Andreasen N，Blennow K.CSF biomarkers for mild cognitive impairment and early Alzheimer's disease〔J〕.Clin Neurol Neurosurg，2005;107(3):165-73.

5 刘春喜，景爱红.阿尔茨海默病中β淀粉样蛋白的神经毒作用〔J〕.济宁医学院学报，2004;27(1):64-7.

6 Bush A，Tanzi RE.The galvanization of beta-amyloid in Alzheimer's disease〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2002;99(11):7317-9.

7 王亚利，宋天保，路 明，等.Aβ诱导PC212细胞凋亡建立阿尔茨海默病细胞模型〔J〕.西安医科大学学报，2002;23(2):129-32.

8 黄 健，沈永生，周宏平，等.AnnexinV/PI、TdT和PI法检测细胞凋亡的比较〔J〕.中华微生物学和免疫学杂志，2000;20(4):387-8.