延髓腹外侧头端活性氧介导室旁核血管紧张素Ⅱ的交感兴奋作用

钟明奎

(安徽医科大学生理学教研室，安徽 合肥 230032)

下丘脑室旁核 (PVN)与神经内分泌和自主神经系统功能的调节密切相关，其下行纤维可投射到脊髓中间外侧柱交感节前神经元和延髓腹外侧头端 (RVLM)〔1〕。PVN存在多种神经递质及其相应受体，其中血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)及其AT1受体在该区含量丰富。PVN内AngⅡ可通过AT1受体引起血压升高和交感神经活动增强，在心血管活动的调节中起着关键作用。RVLM是心血管功能调节的中心区域，有发放紧张性冲动的心血管运动神经元，脑内升压、降压调节区主要通过它投射到脊髓中间外侧柱，是中枢神经系统对心血管活动调节的最后通路。研究表明PVN-RVLM通路在交感神经系统和心血管活动的调节中起着重要作用〔2〕。对PVN神经元的化学刺激可使RVLM中的网状脊髓束血管运动神经元兴奋，使血压升高。然而，PVN内AngⅡ引起的升压作用是否涉及PVN-RVLM传出通路及其机制还不清楚。本研究探讨RVLM内活性氧 (ROS)在介导PVN内AngⅡ引起的交感神经活动增强的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雄性成年SD大鼠，体重300～400 g，由南京医科大学实验动物中心提供。

1.2 仪器和药品 PowerLab/8SP数据分析处理系统、桥式放大器 (ADInstruments，澳大利亚)，交流/直流差分放大器(A-M System Inc.，美国)，脑立体定位仪、微量注射泵(Stoelting Co.，美国)，小动物呼吸机 (Harvard Apparatus Inc.，美国)。AngⅡ、超氧阴离子清除剂4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶 (Tempol)、内源性超氧化物歧化酶拟似物聚乙二醇-超氧化物歧化酶 (polyethylene glycol-superoxide dismutase，PEG-SOD)用生理盐水配制，NAD(P)H氧化酶抑制剂夹竹桃麻素 (Apocynin)或氧化酚砷 (phenylarsine oxide，PAO)用1%二甲基亚砜 (DMSO)配制，上述药品均购自美国Sigma公司。

1.3 动物手术 腹腔注射氨基甲酸乙酯 (800 mg/kg)和氯醛糖 (40 mg/kg)混合麻醉，每小时静脉注射初始麻醉剂量的1/10维持麻醉。颈部正中切口，气管插管与呼吸机相连行正压呼吸，右侧颈外静脉插管用于静脉给药。暴露双侧颈动脉窦区，分离并切断所有支配颈动脉窦的神经纤维，切断双侧迷走神经，剥离颈总动脉分叉处上下各4 mm范围内动脉周围结缔组织，并涂以10%苯酚溶液以破坏该区域残余的神经纤维。确认压力感受器去神经支配成功的标准:静脉注射苯肾上腺素 (20μg/kg)后平均动脉压 (MAP)增加25 mmHg以上时心率 (HR)变化不超过5次/min，则压力感受器去神经支配成功。

1.4 血流动力学和肾交感神经活动记录 用充有肝素生理盐水溶液的PE-50聚乙烯管插入右侧颈总动脉，经压力传感器与四通桥式放大器相连，经PowerLab数据分析处理系统记录动脉血压，并对血压信号进行处理，同步记录动脉血压、MAP和HR。经腰部纵行切口沿腹膜后路径暴露肾脏，游离肾交感神经，并浸入温石蜡油中，安放银丝电极引导肾交感神经活动 (RSNA)，经交流/直流差分放大器放大后用Power-Lab数据分析处理系统记录RSNA，并对RSNA进行积分处理，同步记录原始RSNA和RSNA积分值。实验结束时切断肾神经中枢端以消除肾交感神经传出活动，记录噪音水平，RSNA积分值减去噪音积分值即为实际RSNA积分值。RSNA的值以变化的百分率来表示。

1.5 立体定位和微量注射 将大鼠头部固定于立体定位仪上，暴露颅骨，根据Paxinos和Watson的大鼠立体定位图谱，定位RVLM(人字缝尖后4.5～5.0 mm，中线旁开1.8～2.1 mm，小脑背侧表面下8.1～8.4 mm)和PVN(AP－1.8 mm，RL 0.4 mm，H 7.9 mm)。用针尖外径为50μm的玻璃微电极向核团内注射药液，注射容积50 nl，30 s内注射完毕。实验结束时核团内注射50 nl的0.25%伊文思蓝溶液，过量麻醉处死大鼠，取脑，将其放入10%甲醛溶液中固定1 w后，脑组织切片鉴定注射位点。

1.6 实验设计和分组 (1)PVN内注射AngⅡ对交感神经活动和动脉血压的影响:大鼠随机分为4组，每组5只，分别在PVN内注射生理盐水、3种剂量的AngⅡ (0.03，0.3和3 nmol)，观察其对RSNA和MAP的影响。(2)RVLM内ROS在介导PVN内AngⅡ效应中的作用:大鼠随机分为3组，每组6只，分别在RVLM内注射生理盐水、Tempol(20 nmol)和PEG-SOD(2 U)，10 min后PVN内注射AngⅡ，观察其对RSNA和MAP的影响。(3)RVLM内NAD(P)H氧化酶在调节PVN内AngⅡ效应中的作用;大鼠随机分为3组，每组6只，分别在RVLM内加DMSO(1%，50 nl)、NAD(P)H氧化酶抑制剂Apocynin(1 nmol)和PAO(1 nmol)，10 min后PVN内注射Ang II，观察其对RSNA和MAP的影响。

1.7 统计学分析 用SPSS10.0软件，所有数据均以x±s表示，同一只动物用药前后观察值的比较采用配对t检验，两组间的比较采用独立样本t检验，多组间的比较采用单因素方差分析并采用SNK检验做样本间的多重比较。

2 结果

2.1 PVN内注射AngⅡ对RSNA和MAP的影响 PVN内微量注射AngⅡ (0.03、0.3或3.0 nmol)剂量依赖性地引起RSNA增强和MAP升高，但对HR无显著影响。与生理盐水组相比，大剂量AngⅡ (3.0 nmol)引起 RSNA〔(0.1±2.2)%vs(12.9±1.9)%，P＜0.01〕和MAP 〔(0.4±1.4)mmHg vs(10.0±1.5)mmHg，P＜0.01〕显著增加。见图1。

2.2 RVLM内ROS在介导PVN内AngⅡ效应中的作用RVLM内微量注射超氧阴离子清除剂Tempol对RSNA和MAP无显著影响，但可明显减弱PVN注射AngⅡ引起的RSNA增强 〔(0.2±2.6)%，vs(10.2±1.9)%，P＜0.01〕和MAP〔(5.2±1.7)mmHg vs(11.0±1.2)mmHg，P＜0.01〕升高效应。RVLM内微量注射PEG-SOD对RSNA和MAP也无显著影响，同样也可抑制PVN注射AngⅡ引起的效应，RSNA:〔0.15±1.6)%，vs(10.2±1.9)%，P＜0.01〕和 MAP〔(4.6±2.0)mmHg vs(11.0±1.2)mmHg，P ＜0.01〕。见图2。

2.3 RVLM内NAD(P)H氧化酶在调节PVN内AngⅡ效应中的作用 RVLM内微量注射NAD(P)H氧化酶抑制剂Apocynin抑制内源性ROS的生成对RSNA和MAP无显著影响，但可明显减弱 PVN注射 AngⅡ引起的 RSNA增强〔(0.2±1.7)%，vs(9.1±2.3)%，P＜0.01〕和 MAP〔(5.0±1.4)mmHg vs(12.3±1.3)mmHg，P＜0.01〕升高效应。RVLM内微量注射另一种NAD(P)H氧化酶抑制剂PAO，同样也可抑制 PVN注射 AngⅡ引起的效应 RSNA〔1.5±2.7)%，vs(9.1±2.3)%，P＜0.01〕和 MAP〔(3.5±1.4)mmHg vs(12.3±1.3)mmHg，P＜0.01〕。见图3。

图1 大鼠PVN内注射AngⅡ对RSNA和MAP的影响(n=5)

图2 RVLM内活性氧在介导PVN内效应中的作用(n=6)

图3 RVLM内NAD(P)H氧化酶在调节PVN内AngⅡ效应中的作用(n=6)

3 讨论

PVN是调节交感神经活动和动脉血压的重要中枢结构之一〔3〕，PVN内AngⅡ可通过AT1受体引起血压升高和交感神经活动增强，在心血管活动的调节中起着关键作用。RVLM有发放紧张性冲动的心血管运动神经元，脑内升压、降压调节区主要通过它投射到脊髓中间外侧柱，是中枢神经系统对心血管活动调节的最后通路。研究表明PVN-RVLM通路在交感神经系统和心血管活动的调节中起着重要作用。本研究发现PVN内微量注射AngⅡ剂量依赖性地引起RSNA增强和MAP升高。应用超氧阴离子清除剂Tempol和内源性超氧化物歧化酶拟似物PEG-SOD清除RLVM内ROS，或应用NAD(P)H氧化酶抑制剂Apocynin和PAO抑制RLVM内ROS的生成可显著减弱PVN内注射AngⅡ引起的交感兴奋效应。结果表明RLVM内NAD(P)H氧化酶来源的ROS介导了PVN内AngⅡ的交感兴奋作用。

Tempol是一种超氧阴离子的清除剂，细胞膜对其具有高度的通透性。本研究发现RVLM微量注射 Tempol几乎完全消除了PVN微量注射AngⅡ引起的RSNA增强和MAP升高效应，提示Tempol可能通过降低RVLM中ROS水平而起作用。Sun等〔4〕发现AngⅡ增加下丘脑及脑干神经元内ROS生成，且AngⅡ引起的神经元放电活动增强与神经元内ROS水平呈正相关;Lu等〔5〕发现中枢注射Tempol可以抑制侧脑室注射AngⅡ引起的RSNA增强，均支持本文结果。考虑到Tempol可能具有一些与清除ROS无关的非特异性作用，笔者又研究了内源性超氧化物歧化酶拟似物PEG-SOD的作用，结果发现PEG-SOD具有与Tempol相似的作用，进一步提示RVLM中的ROS在介导PVN中AngⅡ引起的交感兴奋中起重要作用。

众多的临床和实验研究表明ROS作为信号分子在心血管疾病的发病机制中起着重要作用〔6〕。ROS是氧在生物体内通过单电子还原产生化学性质活泼的物质，包括超氧负离子自由基()、过氧化氢(H2O2)和羟基自由基(·OH)等。涉及ROS生成的酶主要包括NAD(P)H氧化酶、黄嘌呤氧化酶和一氧化氮合酶(NOS)〔7〕，其中NAD(P)H氧化酶在心血管、神经退行性疾病的发病以及在正常心血管、神经系统功能调控中起了重要作用〔8〕。NAD(P)H氧化酶可被某些激素和组织局部代谢产物等激活，使酶的活性显著增加〔9〕。众多研究表明在血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、外膜细胞和心肌细胞等多种细胞中，AngⅡ是NAD(P)H氧化酶的重要的激活物之一〔10〕，可上调大部分NAD(P)H氧化酶亚基的基因表达〔11〕，目前NAD(P)H氧化酶和中枢AngⅡ的关系成为人们关注的焦点。Zimmerman等〔12〕用Rac1显性失活同形物抑制NAD(P)H氧化酶的活性后，AngⅡ所引起的ROS生成也被抑制，同时也消除了中枢AngⅡ引起的升高血压和增加饮水行为效应。AngⅡ兴奋NTS、下丘脑、脑干等中枢自主神经元的效应伴随着该部分神经元内NAD(P)H氧化酶活性及ROS水平的增加〔13〕，提示AngⅡ可激活外周组织及中枢神经系统NAD(P)H氧化酶。

Apocynin是一种NAD(P)H氧化酶的抑制剂，它通过干扰NAD(P)H氧化酶的装配，即干扰p47phox和p67phox与NAD(P)H氧化酶的膜复合物结合，从而抑制外周和中枢组织中超氧阴离子的生成〔14〕。PAO是另一种NAD(P)H氧化酶抑制剂，其分子结构和作用机制与Apocynin不同，它不干扰酶的胞浆成分转移及其与膜成分的结合，而是作用于NAD(P)H氧化酶膜相关蛋白的邻位巯基结构，与其形成一个稳定的五环结构，从而影响超氧阴离子的生成〔15〕。本研究发现RVLM内注射Apocynin或 PAO均可抑制 PVN内 AngⅡ的作用，提示RLVM内NAD(P)H氧化酶来源的ROS介导了PVN内AngⅡ的交感兴奋作用。

本研究发现还发现应用超氧阴离子清除剂Tempol和内源性超氧化物歧化酶拟似物PEG-SOD清除RLVM内ROS，或应用NAD(P)H氧化酶抑制剂Apocynin和PAO抑制RLVM内ROS的生成对RSNA和MAP没有显著影响，表明在正常生理状况下RLVM内源性ROS不参与心血管活动的调节。

综上，本研究表明RVLM中的ROS介导PVN中AngⅡ 引起的交感兴奋增强，NAD(P)H氧化酶是该过程中ROS生成的重要起源。

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