中国不同地区蜂胶的抑菌性研究

龚上佶, 郭夏丽, 罗丽萍, 付宇新, 徐元君, 陈 滨

蜂胶是意大利蜜蜂(Apis mellifera)采集植物芽苞分泌物或伤口处流出的黏液、树脂等,并混入蜂蜡和其它分泌物经咀嚼加工而成的一种黏稠物质[1].近些年来研究者对蜂胶的药理活性及化学成分进行了全面的研究,发现蜂胶具有抗菌性、抗病毒、消炎、保肝、抗癌等广泛的药理活性[2-5].由于蜂胶具有重要的医药功效,有很广泛的应用价值,常被做成药品或保健品.

蜂巢内环境潮湿、温度适宜、空间狭小,非常适宜微生物的生长,而蜂胶是抑制微生物生长的“功臣”,具有很强的抑菌性[6].蜂胶作为传统的医药,使用历史悠久,但目前对中国产蜂胶的基础研究还比较薄弱,尤其是对中国蜂胶的抑菌性研究不多,研究的菌种也非常有限.

为了对中国蜂胶抑菌性有较全面的了解,本课题组从中国不同省份采集29个蜂胶样本,研究它们对9种常见菌种(金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、产气杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、青霉、曲霉、毛霉和根霉)的抑菌性.通过研究中国蜂胶醇提物(ethanol extract of propolis,简称EEP)对这9个菌种的抑菌圈直径和最小抑菌浓度,从而直观且科学地评价中国蜂胶的抑菌性.并在此基础上,根据样品采集地所属气候区域将29个样品分为5类(高原高寒气候、温带大陆气候、温带季风气候、亚热带季风气候和热带季风气候),分析了不同气候区域EEP的抑菌性差异,从而为我国蜂胶应用研究及蜂胶作为抑菌剂的商品化提供理论依据.

1　材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1蜂胶样品

29种蜂胶样品分别采自中国23个省份,详细情况见表1.

表1　不同地区蜂胶特征[7]Tab.1　Characteristics of propolis from diff erent areas

1.1.2试验菌种

枯草杆菌 (Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、产气杆菌 (Clostridium perfringens)、大肠杆菌 (Escherichia coli)、变形杆菌(Poteusbacillus vulgaris)、毛霉 (Mucor racemosus)、青霉 (Penicillium glaucum)、曲霉 (Aspergillus niger)、根霉(Rhizopus nigricans).

1.1.3试剂与仪器

蛋白胨和牛肉膏,北京奥博星生物技术有限责任公司;琼脂;氯化钠、葡萄糖(分析纯);涂布棒、接种针、酒精灯、超净工作台,苏净集团安泰公司(SWCJ- 2FD);GZX -DH.600--S--II型恒温培养箱,上海跃进医疗器械厂.

1.2　实验方法

1.2.1蜂胶样品前处理

将蜂胶样品置于-18℃条件下冷冻,变硬变脆后打成小碎块,去除杂质,用药材粉碎机粉碎并用1.18 mm的网目过滤,混匀后放于冰箱中备用.

1.2.2蜂胶醇提物的制备

取1 g蜂胶粉末,用60%乙醇溶液按固液比1∶20在35℃提取4 h后过滤,再用相应浓度乙醇分3次冲洗过滤,滤液于50℃真空减压旋转蒸发至干燥,得到固态的EEP,置于-18℃中保存备用.使用时,用乙醇复溶,配制成20 mg·mL-1的溶液.

1.2.3培养基的制备[8]

肉汤培养基:蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化钠5 g、琼脂20 g,加双蒸水至1 000 mL,调至pH 7.2～7.6.

真菌培养基:蛋白胨 10 g、葡萄糖 40 g、加双蒸水至1 000 mL,调至pH 7.1.

1.2.4抑菌圈的测定

采用琼脂稀释法测定抑菌圈[9].配制浓度为1.5×108个·mL-1的菌悬液,用5.0麦氏比浊法校正.将200μL的菌种悬浊液加入到固体培养基上,细菌使用肉汤培养基,真菌使用真菌培养基.无菌滤纸圆片(D=5.5 mm)加7μL EEP后,均匀贴在上述培养基上.在37℃恒温培养箱内培养(细菌24 h,真菌培养48 h),测量并记录抑菌圈直径,每个菌种重复3次.

1.2.5最小抑菌浓度的测定[10]

将EEP母液稀释成不同浓度,加于含有等量菌悬浊液的96孔的平板内,混合均匀,然后将平板放在37℃恒温培养箱内培养(细菌24 h,真菌48 h),观察试验菌生长情况,以不长菌的最小EEP浓度(mg·mL-1)为最小抑菌浓度.

2　结果与讨论

2.1　各地蜂胶对9个菌种的抑菌圈直径和最小抑菌浓度

各地蜂胶对9个菌种的抑菌圈直径和最小抑菌浓度实验结果见表2.抑菌圈直径和最小抑菌浓度进行相关性分析,呈负相关显著,说明抑菌圈越大,最小抑菌浓度越小,抑菌性越大.

表2　不同地区蜂胶醇提物的抑菌圈直径(mm)和最小抑菌浓度(mg·g-1)Tab.2　Zones of inhibition of EEP from different areas(mm)and MIC(mg·g-1)

2.2　不同气候区域EEP对革兰氏阳性菌的抑菌性

不同气候区域EEP,对枯草杆菌的抑菌圈(mm,以下单位相同)平均为:高原高寒(14.2)＞温带大陆(13.6)＞温带季风(12.9)＞亚热带季风(11.6)＞热带季风(9.7);对金黄色葡萄球菌的平均抑菌圈直径基本没有差异,抑菌圈分别为:9.43(温带大陆)、9.42(温带季风)、9.37(亚热带季风)、9.31(高原高寒)和9.25(热带季风);对产气菌的平均抑菌圈为:温带季风(9.35)＞温带大陆(8.93)＞亚热带季风 (8.89)＞高原高寒 (8.74)＞热带季风(8.26).

上述结果表明:不同气候区域EEP对革兰氏阳性菌都具有较好的抑菌性,而对枯草杆菌的抑菌性最强.

2.3　不同气候区域EEP对革兰氏阴性菌的抑菌性

不同气候区域EEP对大肠杆菌的平均抑菌圈为:温带大陆 (10.41)＞高原高寒 (10.35)＞温带季风(10.22)＞亚热带季风 (10.19)＞热带季风(8.47);对变形杆菌的平均抑菌圈为:亚热带季风(8.09)＞温带季风(7.78)＞温带大陆(7.63)＞高原高寒(6.94)＞热带季风(6.88).

上述结果表明:不同气候区域EEP对革兰氏阴性菌的抑菌性没有对革兰氏阳性菌强,特别是对变形杆菌的抑菌性很弱;不同的气候区域中,热带季风EEP的抑菌性最弱.

2.4　不同气候区域EEP对真菌的抑菌性

不同气候区域EEP对毛霉的平均抑菌圈为:温带大陆 (11.13)＞温带季风(10.96)＞高原高寒(10.63)＞亚热带季风(9.95)＞热带季风(8.32);对青霉的平均抑菌圈为:高原高寒(10.72)＞温带大陆 (10.67)＞亚热带季风(9.96)＞温带季风(9.84)＞热带季风 (8.18);对曲霉的平均抑菌圈直径为:高原高寒(11.75)＞温带季风(11.62)＞温带大陆(10.39)＞亚热带季风(9.84)＞热带季风(9.25);对根霉的平均抑菌圈直径大小为:高原高寒(13.56)＞亚热带季风(11.83) ＞温带大陆(11.98)＞温带季风(10.82)＞热带季风(10.46).

上述结果表明,中国不同气候区域EEP对真菌有较强的抑菌性.从气候区域来看,高原高寒EEP具有很好的抑菌性,而热带季风EEP对真菌的抑菌性明显弱于其他气候区域.

2.5　不同地区EEP对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的抑菌性比较

不同地区EEP对革兰氏阳性菌的平均抑菌圈为9.88 mm±1.47 mm,对革兰氏阴性菌的平均抑菌圈为8.75 mm±1.56 mm,对真菌的平均抑菌圈为10.01 mm±0.65 mm,可见中国不同地区EEP对真菌的抑菌性最强,其次为革兰氏阳性菌,对革兰氏阴性菌的抑菌性最弱.在这9个菌种中,对变形杆菌的抑菌性最差,对根霉的抑菌性最好.

Dixon[11]认为蜂胶对革兰氏阴性菌的抑菌性弱是因为蜂胶中的主要成分是植物的分泌物,而植物多受革兰氏阳性菌的侵害,因此植物分泌的物质大多是保护植物免受对革兰氏阳性菌的危害.还有一种理论由Bendel[12]提出,他认为蜜蜂的巢穴容易受一种瓦螨类寄生虫的侵害,而这种寄生虫是一种革兰氏阳性菌,因此对革兰氏阳性菌的抑菌性更强.

3　结 论

1)中国不同地区EEP对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌都具有较好的抑菌性.对真菌的抑菌性最强,其次为革兰氏阳性菌,对革兰氏阴性菌的抑菌性最弱.在文中所用9个菌种中,对变形杆菌的抑菌性最差,对根霉的抑菌性最好.

2)温带EEP抑菌性最强,亚热带EEP次之,而热带EEP最弱.不同气候区域蜂胶的EEP抑菌性没有显著差异.